L-鼠李糖抗体在制备预防和/或治疗耐药细菌感染的药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及L

【技术实现步骤摘要】
L
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鼠李糖抗体在制备预防和/或治疗耐药细菌感染的药物中的应用


[0001]本专利技术涉及L
‑
鼠李糖抗体在制备预防和/或治疗耐药细菌感染的药物中的应用，属于医药


技术介绍

[0002]耐药细菌是指在长期的抗生素选择之后产生的对相应抗生素有耐受能力的细菌。抗生素的长期、广泛、过度使用，使得部分细菌发生变异成为耐药细菌，这种耐药性既会传给下一代，也会被其它细菌获得。
[0003]细菌耐药性已成为全球医学界共同关注的严峻问题。目前，临床用于治疗耐药细菌感染的手段十分有限，主要是通过痰液培养和/或药敏试验调整抗生素使用的种类或剂量。然而对于一些超级耐药细菌，常常面临无药可用的境地。此外，人们针对耐药细菌进行了大量研究，主要期望通过以下方式克服耐药细菌感染：1)直接针对耐药细菌开发新的抗生素，然而细菌耐药产生的速度远远超越新的抗生素的研发速度，且抗生素研发难度越来越大。2)克服耐药机制，恢复细菌对抗菌药物的敏感性，例如针对耐药细菌产生的β
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内酰胺酶，研究合成酶抑制剂，将酶抑制剂和抗生素联合使用，在克服细菌耐药的同时发挥抗生素的杀菌作用，但迄今为止，临床可供使用的只有β
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内酰胺酶抑制剂和青霉素(或头孢菌素)复方应用，其他众多耐药机制尚无法克服。3)抗生素替代产品，如抗菌多肽、噬菌体等，但大多停留在实验研究阶段，离临床应用还很遥远。
[0004]L
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鼠李糖(L
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rhamnose，L
>‑
Rha)，即6
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脱氧
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L
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甘露糖，在自然界中有两条合成途径：rml 途径和gdp途径。其中，rml途径存在于42％细菌、21％古生菌的基因组中，gdp途径存在于部分细菌(主要是铜绿假单胞菌和杆菌属)、植物、真菌、藻类的基因组中。其中，有相当一部分耐药细菌的基因组内有L
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鼠李糖合成基因，例如鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌、结核分支杆菌、麻风分枝杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、弗氏志贺菌、淋病奈瑟氏菌、屎肠球菌、粪肠球菌、肠道沙门氏菌、艰难梭菌、伤寒沙门氏菌、酿脓链球菌的全部或部分血清型。L
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鼠李糖作为抗原决定簇，常参与细菌表面糖抗原的组成，帮助病原菌的鉴别和诊断。
[0005]哺乳动物包括人类不含有L
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鼠李糖的合成途径。相反地，健康人体内天然存在大量的L
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鼠李糖抗体，它是由Gildersleeve JC等人发现的。此后有许多工作利用L
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鼠李糖抗体在人体内天然且大量存在的事实来增强抗原(通过连接L
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鼠李糖)的免疫原性。例如，连接有L
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鼠李糖的肿瘤抗原被注射入L
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鼠李糖抗体小鼠模型后，L
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鼠李糖与小鼠体内大量存在的L
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鼠李糖抗体结合，从而增强抗原递呈细胞对肿瘤抗原的识别和摄取。
[0006]尽管有文献报道天然抗体可参与天然免疫，在清除病原菌方面发挥着重要作用。L
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鼠李糖抗体天然且大量存在于人体内的意义之一可能是抵御含有L
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鼠李糖抗原的细菌的感染。较弱的L
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鼠李糖天然抗体水平可能无法给人提供有效的抵御这部分细菌侵袭的能力。因此，为 L
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鼠李糖天然抗体水平低下的人群提高L
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鼠李糖抗体水平，可以起到广谱的
抗耐药细菌感染的预防和/或治疗作用。
[0007]基于上述原理，本专利技术提供了一种具有新作用机制和/或新化学结构的预防和/或治疗耐药细菌感染的药物，具有极其重要与深远的意义。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足，本专利技术提供了L
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鼠李糖抗体在制备预防和/或治疗耐药细菌感染的药物中的应用。
[0009]术语说明：
[0010]室温：具有本领域公知的含义，一般是指25
±
2℃。
[0011]NHS：N
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羟基琥珀酰亚胺。
[0012]ELISA：酶联免疫吸附剂测定。
[0013]柱体积：1个柱体积是指L
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鼠李糖亲和层析柱中琼脂糖凝胶的体积，其中柱子指的是亲和层析柱空柱，柱体为聚丙烯材料，柱子下出口有筛板，用以阻挡琼脂糖凝胶渗出。
[0014]PBS：磷酸盐缓冲溶液，其中1
×
PBS指的是0.01M PBS溶液；3
×
PBS指的是0.03M PBS 溶液。
[0015]本专利技术的技术方案如下：
[0016]L
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鼠李糖抗体在制备预防和/或治疗耐药细菌感染的药物中的应用，其特征在于，所述L
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鼠李糖抗体特异性地识别L
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鼠李糖，所述L
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鼠李糖抗体为人源L
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鼠李糖天然抗体或鼠源L
‑ꢀ
鼠李糖单克隆抗体；所述耐药细菌特指基因组中含有L
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鼠李糖合成途径的耐药细菌。
[0017]根据本专利技术优选的，所述人源L
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鼠李糖天然抗体的制备方法步骤如下：
[0018](1)合成L
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鼠李糖
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NH2[0019]将L
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鼠李糖经乙酰基保护和苯硫酚糖基化反应后得到中间产物1，中间产物1与3
‑
叠氮基丙醇连接得到中间产物2，中间产物2经脱乙酰基保护和还原反应得到L
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鼠李糖
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NH2；
[0020][0021](2)制备L
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鼠李糖亲和层析柱
[0022]取NHS活化的琼脂糖凝胶装柱，经冲洗和平衡后加入步骤(1)制备的L
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鼠李糖
‑
NH2，混合均匀，室温下缓慢摇动反应3～5小时，然后加入封闭液，室温下缓慢摇动反应0.5～1.5 小时，再经洗涤液A、洗涤液B洗涤后得到L
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鼠李糖亲和层析柱，4℃保存于20％乙醇中；
[0023](3)纯化L
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鼠李糖天然抗体
[0024]取步骤(2)制备的L
‑
鼠李糖亲和层析柱，经冲洗和平衡后加入血清，混合均匀后室温孵育3～4小时，再次冲洗L
‑
鼠李糖亲和层析柱后进行洗脱，收集洗脱液，调节洗脱液的pH 为中性，最后洗脱液经超滤浓缩后得到人源L
‑
鼠李糖天然抗体。
[0025]根据本专利技术优选的，步骤(1)中，所述L
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鼠李糖和苯硫酚的摩尔比为1:1.1；所述中间产物1与3
‑
叠氮基丙醇的摩尔比为1:2。
[0026]根据本专利技术优选的，步骤(2)中，所述冲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.L
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鼠李糖抗体在制备预防和/或治疗耐药细菌感染的药物中的应用，其特征在于，所述L
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鼠李糖抗体特异性地识别L
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鼠李糖，所述L
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鼠李糖抗体为人源L
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鼠李糖天然抗体或鼠源L
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鼠李糖单克隆抗体；所述耐药细菌为基因组中含有L
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鼠李糖合成途径的耐药细菌。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人源L
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鼠李糖天然抗体的制备方法步骤如下：(1)合成L
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鼠李糖
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NH2将L
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鼠李糖经乙酰基保护和苯硫酚糖基化反应后得到中间产物1，中间产物1与3
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叠氮基丙醇连接得到中间产物2，中间产物2经脱乙酰基保护和还原反应得到L
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鼠李糖
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NH2；(2)制备L
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鼠李糖亲和层析柱取NHS活化的琼脂糖凝胶装柱，经冲洗和平衡后加入步骤(1)制备的L
‑
鼠李糖
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NH2，混合均匀，室温下缓慢摇动反应3～5小时，然后加入封闭液，室温下缓慢摇动反应0.5～1.5小时，再经洗涤液A、洗涤液B洗涤后得到L
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鼠李糖亲和层析柱，4℃保存于20％乙醇中；(3)纯化L
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鼠李糖天然抗体取步骤(2)制备的L
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鼠李糖亲和层析柱，经冲洗和平衡后加入血清，混合均匀后室温孵育3～4小时，再次冲洗L
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鼠李糖亲和层析柱后进行洗脱，收集洗脱液，调节洗脱液的pH为中性，最后洗脱液经超滤浓缩后得到人源L
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鼠李糖天然抗体。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述L
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鼠李糖和苯硫酚的摩尔比为1:1.1；所述中间产物1与3
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叠氮基丙醇的摩尔比为1:2。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述冲洗的冲洗液为预冷后的1mM HCl，冲洗液体积为10～15个柱体积；所述平衡的平衡液为0.2M NaHCO3、0.5M NaCl溶液，pH 8～9，平衡液体积为3～5个柱体积；所述L
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鼠李糖
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NH2的加入量为1～2个柱体积，浓度为5～15mg/mL；所述封闭液为0.1M Tris
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HCl溶液，pH 8.5，加入量为3～5个柱体积；所述洗涤液A为0.1M Tris
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HCl、0.5M NaCl溶液，pH 8～9；洗涤液B为0.1M HCOOH、0.5MNaCl溶液，pH 3～5；洗涤液A和B交替洗涤3～6次，每次洗涤过程中洗涤液A的体积为2～4个柱体积，洗涤液B的体积为2～4个柱体积，最后用2～4个柱体积的去离子水冲洗1～2次；步骤(3)中，所述冲洗的冲洗液为去离子水，冲洗液体积为10～15个柱体积；所述平衡的平衡液为1
×
PBS缓冲液，pH 7.4，平衡液体积为10～15个柱体积；所述血清为健康成人血清，血清加入量为10～15个柱体积。所述洗脱的洗脱液为0.2M甘氨酸溶液，pH 2～3；所述超滤浓缩使用8～12kDa的超滤管进行。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鼠源L
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鼠李糖单克隆抗体的制备方法步骤如下：(1)合成L
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鼠李糖
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NHS将L
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鼠李糖
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NH2与琥珀酰反应得到中间产物3，中间产物3被2
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琥珀酰亚胺基
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1,1,3,3
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四甲基脲四氟硼酸酯活化后，得到L
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鼠李糖
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NH...

【专利技术属性】
技术研发人员：马中瑞，张化杰，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：