一种菰米遗传转化体系建立的方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域。受限于菰米胚性愈伤的培养以及再生效率的低下，菰米的遗传转化体系迟迟未能建立。本发明专利技术一方面通过优化菰米胚性愈伤的培养条件和培养方式以及优化愈伤再生的培养基，极大程度地提高菰米愈伤的再生效率，为农杆菌侵染提供优质的胚性愈伤受体材料，为转化奠定坚实的基础；另一方面通过实验探究优化转化过程中的处理方式和培养条件，得到转化阳性株系，顺利建立稳定的农杆菌介导的菰米遗传转化体系。菌介导的菰米遗传转化体系。

【技术实现步骤摘要】
一种菰米遗传转化体系建立的方法


[0001]本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种菰米遗传转化体系建立的方法。

技术介绍

[0002]中国菰(Zizania latifolia)起源于中国，分布于日本、韩国、印度和东南亚中南半岛国家。除西藏外，中国各地尤其是长江流域的河流、湖泊、沟渠、池塘、稻田周围中都有中国菰的分布。菰米(wild rice)是中国菰的颖果，它在我国作为粮食食用已经有3 000多年的历史，在古代是供帝王食用的重要的“六谷”(稻、黍、稷、粱、麦、菰)之一。唐代之后，随着人口数量的大幅度增长、围湖造田等各种农事活动增多，以及水稻种植技术的推广，再加上菰米采收和脱壳较为困难，菰米渐渐淡出人们的视线。随后，菰米逐渐作为中药材使用，明代李时珍《本草纲目》等著作有将菰米用于治疗消渴症(糖尿病)和胃肠疾病的记载。菰米由于较高的营养价值以及独特的风味，开始广泛出现在餐桌、商店里，受到越来越多人的欢迎。
[0003]目前，中国菰的生物活性和保健作用已被中国和韩国等东亚科学家广泛关注。菰米已经证实的生物活性和保健价值包括抗氧化活性、改善胰岛素抵抗、改善脂质毒性以及预防心血管疾病等。菰属植物营养成分的研究主要集中在其种子即菰米当中，菰米不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等营养成分，而且含有大量的抗性淀粉、膳食纤维、植物甾醇、花青素和原花青素等生物活性物质。与北美菰米相比，中国菰米的长度和直径更小。与大米相比，菰米是一种高蛋白、低脂的健康食品。
[0004]菰米自身也有一些局限性，比如含有落粒基因，导致成熟的种子容易落粒等特征，不适用于大规模生产应用。因此，对于菰米相关基因的功能研究显得尤其重要，对于菰米的基因工程相关的技术和研究急待突破。然而，一直受限于菰米胚性愈伤的培养以及再生效率的低下，菰米的遗传转化体系迟迟未能建立。

技术实现思路

[0005]针对目前农杆菌介导的菰米遗传转化体系尚未建立的上述问题，本专利技术提供一种菰米遗传转化体系建立的方法。本专利技术中，一方面通过优化菰米胚性愈伤的培养条件和培养方式以及优化愈伤再生的培养基，极大程度地提高菰米愈伤的再生效率，为农杆菌侵染提供优质的胚性愈伤受体材料，为转化奠定坚实的基础；另一方面通过实验探究优化转化过程中的处理方式和培养条件，得到转化阳性株系，顺利建立稳定的农杆菌介导的菰米遗传转化体系。
[0006]本专利技术是这样实现的，菰米遗传转化体系建立的方法，包括以下步骤：
[0007]1)诱导培养：将成熟菰米种子在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，在愈伤诱导培养基上继代培养，挑选状态良好的愈伤组织转至愈伤诱导培养基上预培养；
[0008]2)农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种于农杆菌活化培养基上活化，用重悬液重悬稀释农杆菌获得OD660值0.2
‑
0.4的农杆菌菌液；
[0009]3)农杆菌菌液的侵染：将步骤1)中经过预培养的愈伤组织浸泡于步骤2)获得的农杆菌菌液中进行侵染15
‑
25min；
[0010]4)愈伤组织的恢复培养和筛选：将步骤3)中侵染后的愈伤颗粒进行共培养，共培养的条件：一次性培养皿垫上三张无菌滤纸后加入终浓度为15
‑
25mg/L的乙酰丁香酮的农杆菌重悬液，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面的农杆菌菌液后均匀分散在共培养介质上，20
‑
28℃黑暗培养2
‑
4d；共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀且稀疏地散布于恢复培养基中，25
‑
35℃光照培养3
‑
6d，光照周期为16h光照/8h黑暗；恢复培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上，培养条件为：25
‑
35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；
[0011]5)愈伤组织再生：将4)所得愈伤颗粒在培养基上筛选3
‑
4周之后，转至再生培养基上，25
‑
35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；苗生长至长度2
‑
5cm，移至生根培养基上，25
‑
35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。
[0012]所述步骤1)愈伤组织诱导培养的条件优选为：光培养，光强4000Lux，光周期16h光照/8h黑暗，温度25
‑
35℃，培养3周后，得胚性愈伤组织。
[0013]诱导培养基的2,4
‑
D的终浓度为2mg/L。
[0014]农杆菌菌种优选为EHA105；优选28℃黑暗培养24h进行第一次活化，然后将活化的农杆菌接种至新鲜的农杆菌活化培养基上，28℃黑暗培养过夜进行二次活化。优选每升接种培养基中加入1毫升终浓度20mg/mL的乙酰丁香酮储存液，分装于50mL灭菌离心管中，每管25mL作为重悬液。
[0015]所述侵染时农杆菌菌液的OD660值最优为0.3，愈伤颗粒侵染时间最优为20min。OD660为0.3的菌液浓度适合后续转化子的筛选，抗性愈伤率更高，且少褐化。过高或过低浓度的菌液都不利于后续转化子的筛选，浓度过低会导致转化效率的降低，而浓度过高则会引起农杆菌过度生长，导致愈伤褐化。
[0016]共培养的培养基含终浓度为20mg/L的乙酰丁香酮，23℃黑暗共培养3d。共培养过程的干燥处理，可以降低共培养过程中的水分含量，起到增加细胞接触和抑制细菌生长的效果，但是又不能太过于干燥，将抑制愈伤的生长。
[0017]恢复培养的条件优选：30℃光照培养5d，光照周期为16h光照/8h黑暗。
[0018]筛选培养的条件优选：30℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。
[0019]再生培养的条件优选：30℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。
[0020]生根培养的条件优选：30℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。
[0021]愈伤诱导培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X50mL；B5微量1，100X10mL；B5微量2，1000X1mL；维生素B5，100X10mL；铁盐100X10mL；谷氨酰胺0.5g；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.3g；2,4
‑
D终浓度1mg/mL，2mL；蔗糖30g；植物凝胶3g。
[0022]YP:乙酰丁香酮农杆菌活化培养基的配方为：酵母提取物10g；蛋白胨10g；NaCl 50g；卡那霉素终浓度50mg/mL，1mL；利福平终浓度10mg/mL，1.5mL；乙酰丁香酮终浓度20mg/mL，1mL；琼脂12g。
[0023]农杆菌重悬液的配方为：每升含N6大量20X50mL；B5微量1，100X10mL；B5微量2，1000X1mL；维生素B5，100X10mL；铁盐100X10mL；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.5g；2,4
‑
D，1mg/mL 2mL；蔗糖20g；葡萄糖10g；乙酰丁香酮终浓度20mg/mL，1mL。
[0024本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菰米遗传转化体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：1)诱导培养：将成熟菰米种子在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，在愈伤诱导培养基上继代培养，挑选状态良好的愈伤组织转至愈伤诱导培养基上预培养；2)农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种于农杆菌活化培养基上活化，用重悬液重悬稀释农杆菌获得OD660值0.2
‑
0.4的农杆菌菌液；3)农杆菌菌液的侵染：将步骤1)中经过预培养的愈伤组织浸泡于步骤2)获得的农杆菌菌液中进行侵染15
‑
25min；4)愈伤组织的恢复培养和筛选：将步骤3)中侵染后的愈伤颗粒进行共培养，共培养的条件：一次性培养皿垫上三张无菌滤纸后加入终浓度为15
‑
25mg/L的乙酰丁香酮的液体培养基，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面的农杆菌菌液后均匀分散在共培养介质上，20
‑
28℃黑暗培养2
‑
4d；共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀且稀疏地散布于恢复培养基中，25
‑
35℃光照培养3
‑
6d，光照周期为16h光照/8h黑暗；恢复培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上，培养条件为：25
‑
35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；5)愈伤组织再生：将4)所得愈伤颗粒在培养基上筛选3
‑
4周之后，转至再生培养基上，25
‑
35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；苗生长至长度2
‑
5cm，移至生根培养基上，25
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35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。2.根据权利要求1所述的一种菰米遗传转化体系建立的方法，其特征在于：所述步骤1)愈伤组织诱导培养的条件为：光培养，光强4000Lux，光周期16h光照/8h黑暗，温度25
‑
35℃，培养3周后，得胚性愈伤组织。3.根据权利要求1所述的一种菰米遗传转化体系建立的方法，其特征在于：所述侵染时农杆菌菌液得OD660值为0.3，愈伤颗粒侵染时间为20min。4.根据权利要求3所述的一种菰米遗传转化体系建立的方法，其特征在于：共培养的培养基乙酰丁香酮终浓度为20mg/L，23℃黑暗培养3d。5.根据权利要求3所述的一种菰米遗传转化体系建立的方法，其特征在于：恢复培养、筛选培养、再生培养及生根培养的条件为：30℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。6.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫宁，吴丹丹，李亚丽，张晶，于秀婷，纪春，杨婷，郑凯丽，张宇，许敏敏，杜咏梅，刘新民，张忠锋，
申请(专利权)人：合肥戬谷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：