一种密码子优化的基因、重组表达载体、重组蛋白及多克隆抗体的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种密码子优化的基因、重组表达载体、重组蛋白及多克隆抗体的制备方法和应用。本发明专利技术提供了一种密码子优化的PE_PGRS45基因，所述PE_PGRS45基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用本发明专利技术所述PE_PGRS45基因能够用于制备效价高的多克隆抗体。本发明专利技术具体实施例中试验结果表明，该基因的密码子适应指数(CAI)从0.73增加到0.90。加到0.90。加到0.90。

【技术实现步骤摘要】
一种密码子优化的基因、重组表达载体、重组蛋白及多克隆抗体的制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种密码子优化的基因、重组表 达载体、重组蛋白及多克隆抗体的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起结核病 (tuberculosis)主要胞内菌。由于卡介苗(BCG)功效低下，抗生素 滥用导致的耐药性增强，使结核病再次威胁全球健康。据世界卫生组 织(WHO)统计，2019年全球范围内，新增加1000万病例，引起 141万患者死亡，是单个传染病导致死亡首要因素。
[0003]结核分枝杆菌PE_PGRS45蛋白由Rv2615c基因编码得到的，与PE_PGRS17 (Rv0978c)和PE_PGRS18(Rv0980c)具有高度同源性。生物信息学分析发现， PE_PGRS45保守的四肽基序(DEVS/DXXS)丝氨酸残基磷酸化后可竞争性与 caspase
‑
3蛋白结合，参与宿主细胞程序化死亡，暗示PE_PGRS45在结核分枝杆菌 感染中具有重要意义。因此，从PE_PGRS45基因着手寻求一种获得高效价的多克 隆抗体的方法是迫在眉睫的。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种密码子优化的基因、重组表达载体、 重组蛋白及多克隆抗体的制备方法和应用。本专利技术将PE_PGRS45基因进行密码子 优化，并以此能得到本专利技术所述PE_PGRS45重组蛋白，进而获得高效价高多克隆 抗体。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种密码子优化的PE_PGRS45基因，所述PE_PGRS45基因核 苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术提供了一种包含上述基因的重组表达载体，所述重组表达载体的基础 质粒包括包括pMAL
‑
c5x。
[0008]优选的，所述基因的核苷酸序列位于所述pMAL
‑
c5x的Nde I和Hind
ꢀⅢ
酶切 位点之间。
[0009]本专利技术提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所 示。
[0010]本专利技术提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白的编码基因的序列包括SEQ IDNO.1所示的序列。
[0011]本专利技术提供了上述重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0012]利用上述重组表达载体转化大肠杆菌后，依次进行培养和诱导，得重组蛋白。
[0013]优选的，在培养时，采用的培养基为含抗生素的LB液体培养基；所述培养的 温度为20～37℃，培养的结束标准为培养所得菌液的OD
600
＝0.4～0.6；
[0014]在诱导时，采用的培养基包括以下浓度的组分：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物 5g/L、氯化钠10g/L、卡那霉素50ug/mL和0.5mM IPTG；
[0015]所述诱导的温度为20～37℃，转速为200r/min，时间为12h。
[0016]本专利技术提供了一种效价高的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0017]以上述重组蛋白为抗原免疫宿主，得抗PE_PGRS45的多克隆抗体。
[0018]本专利技术提供了上述制备方法制备得到的多克隆抗体在制备诊断结核病试剂盒 中的应用。
[0019]本专利技术提供了一种用于诊断结核病的试剂盒，包括上述制备方法制备得到的 多克隆抗体。
[0020]本专利技术提供了一种密码子优化的PE_PGRS45基因，所述PE_PGRS45基因核 苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用本专利技术所述PE_PGRS45基因能够获得效价高 的多克隆抗体。本专利技术具体实施例中试验结果表明，该基因的密码子适应指数(CAI) 从0.73增加到0.90。
附图说明
[0021]图1为结核分枝杆菌PE_PGRS45同源氨基酸序列对比图，其中，M.tuberculosis 为结核分枝杆菌，M.bovis为牛分枝杆菌，M.africanum为非洲分枝杆菌，M.Canettii 为卡耐提分枝杆菌，M.Caprae为山羊分枝杆菌，每排最下面的序列为M. tuberculosis、M.bovis、M.africanum、M.Canettii和M.Caprae 5中菌相同的序列；
[0022]图2为结核分枝杆菌PE_PGRS45基因密码子分析图；
[0023]图3为重组表达载体鉴定结果，其中A为NcoⅠ和XhoⅠ酶切重组表达载体 pET
‑
28a
‑
PE_PGRS4结果，M为DNA marker，1为pET
‑
28a
‑
PE_PGRS4重组表达 载体，B为NcoⅠ和XhoⅠ酶切重组表达载体pET
‑
32a
‑
PE_PGRS45结果，M为 DNA marker，1为重组表达载体pET
‑
32a
‑
PE_PGRS45，C为Nde
ꢀⅠ
和Hind III酶 切重组表达载体pMAL
‑
c5x
‑
PE_PGRS45结果，M为DNA marker，1为重组表达载 体pMAL
‑
c5x
‑
PE_PGRS45；
[0024]图4为密码子优化后pET
‑
28a
‑
PE_PGRS45和pET
‑
32a
‑
PE_PGRS45重组表达 载体SDS
‑
PAGE分析，A为20℃时pET
‑
28a
‑
PE_PGRS45在大肠杆菌中的融合表 达，B为37℃时pET
‑
28a
‑
PE_PGRS45在大肠杆菌中的融合表达，C为20℃时 pET
‑
32a
‑
PE_PGRS45在大肠杆菌中的融合表达，D为37℃时pET
‑
32a
‑
PE_PGRS45 在大肠杆菌中的融合表达，M为蛋白质标记，1为诱导前大肠杆菌细胞，2为诱导 后的大肠杆菌细胞，3为裂解液上清液，4为裂解物沉淀剂；
[0025]图5为密码子优化后pMAL
‑
c5x
‑
PE_PGRS45重组表达载体SDS
‑
PAGE分析， A为20℃时pMAL
‑
c5x
‑
PE_PGRS45在大肠杆菌中的融合表达，B为37℃时 pMAL
‑
c5x
‑
PE_PGRS45在大肠杆菌中的融合表达，M为蛋白质标记，1为诱导前 大肠杆菌细胞，2为诱导后的大肠杆菌细胞，3为裂解液上清液，4为裂解物沉淀 剂；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种密码子优化的PE_PGRS45基因，其特征在于，所述PE_PGRS45基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种包含权利要求1所述基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的基础质粒包括pMAL
‑
c5x。3.根据权利要求2所述重组表达载体，其特征在于，所述基因的核苷酸序列位于所述pMAL
‑
c5x的Nde I和HindⅢ酶切位点之间。4.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。5.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的编码基因的序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。6.权利要求4或5所述重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求2或3所述重组表达载体转化大肠杆菌后，依次进行培养和诱导，得重组蛋白。7.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：许涛，汪洪涛，钱中清，李敏英，王楚彤，袁美丽，
申请(专利权)人：蚌埠医学院，
类型：发明
国别省市：