一种碱基编辑工具及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种碱基编辑工具及其构建方法。为了提高现有PE2系统目标碱基编辑效率和精准度，本发明专利技术提供一种新的碱基编辑工具及其构建方法，所述的碱基编辑工具所述的碱基编辑工具包括SunTag系统和PE2系统。本发明专利技术首次利用SunTag系统和PE系统结果，采用SunTag系统和编辑效率更高的PE2版本，构建SunTag

【技术实现步骤摘要】
一种碱基编辑工具及其构建方法


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体涉及一种碱基编辑工具及其构建方法。

技术介绍

[0002]基因组编辑(简称为基因编辑)技术是利用人工核酸酶对基因组进行靶向修饰的遗传工程技术，是当今生命科学领域的研究热点。人工核酸酶主要包含锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease，ZFN)、TALEN核酸酶(Transcription Activator
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Like Effector Nuclease)以及CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR
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associated protein 9)。利用这些技术，人们可以根据自身研究的需求对感兴趣的基因进行敲除或过表达等操作，进而研究基因的功能和调控机制。
[0003]CRISPR/Cas9系统是存在于细菌和古细菌中的一种免疫防御机制，用来抵抗噬菌体以及外源DNA的入侵，基于CRISPR系统开发而来的基因编辑系统已经被广泛运用于动物、植物和人细胞的基因编辑。CRISPR/Cas9基因编辑系统的核心是一个RNA蛋白复合物，由能与基因组中靶DNA序列互补结合的sgRNA和Cas9核酸酶两部分组成。当该复合物与靶位点结合之后，会激活Cas9的核酸酶活性，从而切割靶DNA，产生双链断裂(DSB)的DNA损伤。DSB进一步激活细胞内的DNA损伤修复机制，主要包括易错的非同源末端连接(Non<br/>‑
homologous End Joining，NHEJ)以及高保真的同源重组修复(Homologous Recombination，HDR)。
[0004]非同源末端连接的修复方式会在靶位点处产生DNA片段的插入或缺失(InDels)，导致移码突变，从而造成靶基因的功能丧失，成为无效等位基因(null allele)。当通过同源重组的方式进行修复时，需要内源的同源序列或者外源导入的同源序列作为修复模板，在靶位点处敲入外源片段或引入点突变。但是，在细胞中，同源重组的效率远远低于非同源末端连接，导致靶位点处修复结果不可控，并倾向于产生核苷酸的插入和缺失。
[0005]为了提高定点突变的效率，将CRISPR/Cas9和其他酶产物进行结合的单碱基编辑系统被相继报道。例如：哈佛大学生物化学家David Liu组开发了base editor系统。base editor单碱基编辑系统主要由sgRNA和融合蛋白两部分组成，其中融合蛋白一般由改造的Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子三者构成，而中科院上海营养与健康研究院常兴课题组开发的融合蛋白仅包含Cas9和胞嘧啶脱氨酶两部分。sgRNA通过与靶位点互补配对，引导融合蛋白结合到靶位点发挥作用。融合蛋白中的胞嘧啶脱氨酶能够使非互补链中相应的胞嘧啶C经脱氨基作用转变为尿嘧啶U，而DNA复制进一步使得U被T代替，而互补链上原来与C的互补碱基鸟嘌呤G将会变成腺嘌呤A，而尿嘧啶糖基化酶抑制子则能够抑制U的切除，最终实现非互补链上的C替换为T和互补链上G替换为A的精确编辑。根据融合蛋白中Cas9蛋白突变体的不同，可以将该系统分为两类，一类选用了无核酸内切酶活性的dCas9，进行编辑时不会造成切割靶DNA；另一类选用了有单链DNA切口酶活性的Cas9n，进行编辑时会在靶基因位点的一条DNA单链产生切口，再以互补链为模板进行合成修复。由于Cas9n和dCas9仍保持与sgRNA结合的能力，但均不会引起双链DNA的断裂，从而抑制了由NHEJ介导的DNA片段的插入或缺失。单碱基编辑系统只能将在胞嘧啶核苷脱氨酶活性位点
附近的C脱氨基，这个区域称为活性窗口。通常胞嘧啶脱氨酶的活性窗口有5个核苷酸，为距离PAM最远端数起的第4～8位核苷酸，这样就会使活性窗口中非靶向的碱基也会发生替换作用。后来的研究者试图通过三种方式来缩短活性窗口，提高基因编辑的精准性，但是效果仍然不十分理想。
[0006]接着，David Liu开发的一种新的基因编辑方法——引导编辑(Prime Editor，PE)，这种方法可以在不引入双链断裂(DSB)和供体DNA模板的前提下，实现靶标位点的插入、缺失和所有12种类型点突变(目前ABE和CBE系统仅能实现C
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T，G
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A，A
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G，T
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C四种突变类型)，扩展了碱基编辑的范围，提高了精准编辑的效率。引导编辑(prime editing)是一种基于“搜索和替换“(search
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and
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replace)的基因组编辑方式。引导编辑的搜索功能是基于改造的向导RNA(the engineered guide RNA，the pegRNA)，pegRNA中包含我们熟知的single guide RNAs(sgRNAs)，不同的是，在其3
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端还有一段引物结合序列(Primer binding site，PBS)和转录模板序列(RT template)。prime editor蛋白由Cas9切口酶(Cas9 nickase，仅有切割单链的功能，H840A)和逆转录酶(M
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MLV RT)融合而成。这样，Cas9切口酶在pegRNA上的sgRNA序列指引下，切割DNA单链，pegRNA 3
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端的PBS(引物结合序列)可以与切割断点前的互补序列识别配对，逆转录酶(M
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MLV RT)以pegRNA上PBS序列后的人工设计的模板序列为模板进行逆转录，将目标序列直接聚合到切口的DNA链上。在PAM识别链上进行单链切割后，会在这条单链DNA上形成3
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末端(3
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flaps)和5
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末端(5
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flaps)两段序列，而5
’
末端会被具有5
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核酸内切酶和5
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核酸外切酶活性FEN1和具有5
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核酸外切酶活性的EXO1蛋白切割。而3
’
末端通过反转录酶合成的编辑序列，就可以更大概率的保留在修复后的序列中。通过这套系统，可以在无需引入双链断裂和外源DNA模板的情况下，有效地产生精确的碱基转换或颠换、插入和缺失等变异。并在PE的基础上，进一步优化和提高了逆转录酶的效率，推出了比PE编辑效率更高的PE2版本。由于PE2编辑后的DNA双链为杂合链，即一条为编辑链，一条为非编辑链。而杂合双链错配修复的模板是随机的，为了解决因错配修复造成的编辑效率降低，他们团队进一步开发出了PE3版本编辑系统，这一版本在非编辑链上距离pegRNA造成的切口处50bp的位置引入了一个新的切口(避免产生双链断裂)，从而让细胞尽量多的以编辑链为模板进行DNA修复，以达到精准编辑的目的。
[0007]然而，不同的PE碱基编辑系统对同一位点进行编辑时，编本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种碱基编辑工具，其特征在于：所述的碱基编辑工具包括SunTag系统和PE2系统。2.根据权利要求1所述的碱基编辑工具，其特征在于：将所述的SunTag系统和所述的PE2系统相结合形成SunTag
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PE2系统，所述的SunTag系统包括GCN4多肽，所述的GCN4多肽能够被单链可变片段抗体识别，所述的PE2系统包括pegRNA、仅有单链DNA切口酶活性的Cas9切口酶、以及逆转录酶，所述的pegRNA的序列包括sgRNA序列、引物结合序列、以及转录模板序列；将多个所述的GCN4多肽与所述的Cas9切口酶的C端和/或N端相连。3.根据权利要求2所述的碱基编辑工具，其特征在于：所述的GCN4多肽的数量为1～20。4.根据权利要求3所述的碱基编辑工具，其特征在于：所述的Cas9切口酶的C端和N端分别连接1～5个所述的GCN4多肽。5.根据权利要求2所述的碱基编辑工具，其特征在于：用于连接所述Cas9切口酶和所述GCN4多肽的接头序列为flexible linker。6.根据权利要求2所述的碱基编辑工具，其特征在于：将所述的逆转录酶和所述的单链可变片段连接形成融合蛋白，将所述的融合蛋白与所述的pegRNA相连。7.根据权利要求6所述的碱基编辑工具，其特征在于：用于连接所述的逆转录酶和所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢红娴，
申请(专利权)人：珠海舒桐医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：