一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统技术方案

本发明专利技术涉及一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统，包括生产系统、浓缩收集系统、循环流体系统。富集收集装置中超滤膜与超滤膜管形成锐角夹角，优选范围为30

【技术实现步骤摘要】
一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统


[0001]本专利技术涉及一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统。
技术背景
[0002]外泌体（EVs）是由脂质双分子层包绕形成的粒径在30
‑
150 nm球状膜性囊泡，是细胞分泌的一种亚细胞结构，在细胞间信息传递过程中起到重要作用。目前收集外泌体的方法主要有超速离心法、超滤法、试剂盒提取等方法。而超速离心法受制于超速离心机价格昂贵，且耗时较长，难以普及应用。试剂盒提取法往往利用化学试剂或修饰的微米纳米材料捕获外泌体，进行纯化，因此会对外泌体表面结构造成一定的破坏。而超滤法是利用截留分子量或粒径尺寸不同，将较大尺寸的颗粒物进行截留，而小粒径或小分子量物质通过，达到提取目的。目前提取EVs的商业化超滤有超滤切向流过滤和中空纤维管两种形式，但依赖进口、价格昂贵且通量小，难以适用于实际规模化生产。

技术实现思路

[0003]针对以上不足，本专利技术目的在于提供一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统，以适用于规模化生产。
[0004]本专利技术目的提供以下方案实现：一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统，包括生产容器和收集容器，包括生产系统、富集收集系统和循环流体系统，其中，所述的生产系统至少包括一个生产容器、搅拌器，生产容器内填充有培养基、3D培养所需的微载体及培养细胞，所述的生产容器设有填料口、出液口和回液口；所述的生产细胞黏附生长在微载体表面，在搅拌器搅拌作用下，使得微载体及表面生长的培养细胞悬浮于湍流培养基中，且湍流的刺激促进外泌体EVs的大量分泌；所述的富集收集系统由可拆卸的超滤膜管、设在超滤膜管内沿流体流动方向与超滤膜管壁行成夹角设置的超滤膜、与超滤膜管密封连接的浓缩外管一、二和收集容器组成，富集收集系统中各组成均可灵活拆卸定期更换，防止污染以及长期使用造成的培养物黏附堵塞，其中，所述的超滤膜管通过两侧的螺旋接口一、二与浓缩外管一、二无缝连接，形成中空的浓缩容器，通过富集收集系统两侧连接口经流体管接入循环流体系统中；收集容器连接在进液方向的浓缩外管一的底部；所述的循环流体系统包括流体管、滤膜、管件连头、蠕动泵和三通阀等，可根据实际所需，流体管通过连接器密封连接至所需的长度；在生产系统中产生的EVs经过滤膜过滤后，随培养基自生产容器的出液口进入循环流体系统，而微载体和培养细胞被阻截在生产容器中继续生产EVs，由蠕动泵将培养基和生产的EVs通过生产容器的出液口流向富集收集系统，同时，富集收集系统中的培养基经回液口重新回流到生产容器内部，最终形成EVs被富集、培养基可循环利用的动态循环流体系统。
[0005]本专利技术提供的便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统装置，可成功应用于培养细胞EVs的富集、纯化收集。
[0006]在上述方案基础上，所述生产系中的生产容器容积为50 mL
‑
60 L，可以是发酵罐、或实验室常见的玻璃培养容器等。
[0007]在上述方案基础上，所述的超滤膜孔径为30
ꢀ‑
200 nm，以满足富集收集系统中的培养基自由通过而截留流体中的EVs，实现EVs的动态富集。
[0008]进一步的，所述的超滤膜与超滤膜管形成的夹角优选范围为30
‑5°
，一定的夹角，使得平行流过浓缩外管的包含富集EVs的流体培养基经过超滤膜时，尽可能避免流体培养基滤液垂直经过超滤膜形成“死滤”，不仅起到超滤作用，同时也会冲带走超滤膜表面截留的EVs，防止后续截留的EVs在超滤膜上积累造成滤孔堵塞，起到模拟切向流过滤效果，使得后续生产容器中培养细胞产生的EVs源源不断的在富集收集系统中富集，可用于包括3D培养细胞在内的任何形式培养细胞产生EVs的富集收集。
[0009]所述富集收集系统不仅适用于3D培养细胞产生EVs的收集，也适用于任何形式培养细胞产生的EVs的富集收集。
[0010]较优的，设在出液口处的滤膜选择滤膜孔隙大小为0.22μm
‑
0.45μm，实际中可根据微载体和培养细胞的粒径选择不同孔隙大小的滤膜。
[0011]在上述方案基础上，所述搅拌器为可更换式，以根据需要调节其尺寸、搅拌桨类型、转速来满足不同类型培养细胞悬浮培养产生EVs所需最佳生长环境。
[0012]本专利技术提供了一种所述的便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统的纯化收集方法，将富集收集系统中得到的富集的含EVs的培养基自回液口重新回流到生产容器内部时， 将生产系统中的培养基换成PBS缓冲液， 使得富集的含EVs的培养基不断被稀释纯化，直至培养基被完全替换为止，打开收集容器，收集到纯化的。
[0013]本专利技术也提供了一种所述的便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统的培养基的更换方法，在循环流体系统中，先将三通阀中的进口和垂直出口打开，三通阀的水平出口关闭，自生产容器的填料口加入新的培养基，从三通阀垂直出口排出旧培养基，实现新旧培养基的便捷更换。
[0014]本专利技术生产系统中，所述的培养细胞包含但不局限于脐带间充质干细胞贴壁黏附性生长细胞。
[0015]本专利技术生产系统中，所述微载体为满足细胞黏附性生长特性的无细胞毒性的微米材料，粒径为20
‑
200μm。
[0016]有益效果相对于目前超速离心法、切向流过滤和中空纤维管超滤法、试剂盒提取等方法。本专利技术超滤富集外泌体时，避免流体培养基滤液垂直经过超滤膜形成“死滤”，不仅起到超滤作用，同时也会冲带走超滤膜表面截留的外泌体，防止后续截留的外泌体在超滤膜上积累造成滤孔的堵塞，起到模拟切向流过滤效果。适用于培养细胞的外泌体边产生富集、纯化收集，获得高浓度、高纯度的外泌体。并且各组成设备均可灵活拆卸定期更换，防止污染以及长期使用造成的培养物黏附堵塞。
[0017]综上所述，该系统装置适用于可持续、成本低、高浓度、高纯度等生产外泌体特点，装置具备显著的经济和社会效益。
附图说明
[0018]图1为专利技术本系统的结构示意图；图2为超滤富集收集装置结构示意图；图3为本专利技术系统装置提取的外泌体透射电子显微镜图；生产系统中，22——生产容器；21——电机；3——培养细胞；4——微载体；5——外泌体（EVs）；6——填料口；7——搅拌器；8——出液口；9——滤膜；24——生产系统的回液口；23——培养基；循环液体系统中，1——流体管；10——蠕动泵；11、12、13——三通阀；14——管道连接器；富集系统中，2——收集容器；15——单向阀；16——富集系统的进口；17——螺旋接口进液口；18——螺旋接口出液口；19——超滤膜；20——富集系统的出口；25——超滤膜管；26——富集系统中培养基；27——富集的EVs；28、29——浓缩外管一、二。
具体实施方式
[0019]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案:实施例1一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统，包括生产系统、富集收集系统和循环流本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统，包括生产容器（22）和收集容器（2），其特征在于，包括生产系统、富集收集系统和循环流体系统，其中，所述的生产系统至少包括一个生产容器（22）、搅拌器（7），生产容器（22）内填充有培养基(23)、3D培养所需的微载体(4)及培养细胞（3），所述的生产容器（22）设有填料口（6）、出液口（8）和回液口（24）；所述的生产细胞(3)黏附生长在微载体(4)表面，在搅拌器（7）搅拌作用下，使得微载体(4)及表面生长的培养细胞（3）悬浮于湍流培养基中，且湍流的刺激促进外泌体EVs（5）的大量分泌；所述的富集收集系统由可拆卸的超滤膜管（25）、设在超滤膜管（25）内沿流体流动方向与超滤膜管壁行成夹角设置的超滤膜（19）、与超滤膜管（25）密封连接的浓缩外管一、二（28）（29）和收集容器（2）组成，通过两侧连接的进、出接口（16）、（20）经流体管（1）接入循环系统中，所述的超滤膜管（25）通过两侧的螺旋接口一、二（17）、(18)与浓缩外管一、二（28）、（29）无缝连接，形成中空的浓缩容器；收集容器（2）连接在进液方向的浓缩外管一（28）的底部；所述的循环流体系统包括流体管（1）、滤膜（9）、管件连头（14）、蠕动泵（10）和三通阀构成的循环系统，产生系统生产的EVs（5）经过滤膜（9）过滤后，随培养基（23）自生产容器的出液口（8）进入循环流体系统，而微载体（4）和培养细胞（3）被阻截在生产容器（22）中继续生产EVs（5），由蠕动泵（10）将培养基（23）和生产的EVs（5）通过出液口（8）流向富集收集系统，同时，富集收集系统中的培养基（26）经回液口（24）重新回流到生产容器（22）内部，最终形成EVs被富集、培养基可循环利用的动态循环流体系统。2.根据权利要求1所述的便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统，其特征在于，所述生产系中的生产容器（22）容积为50 mL
‑
60 L，为发酵罐、或玻璃培养容器。3.根据权利要求1所述的便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统，其特征在于，所述的超滤膜（19）孔径为30
ꢀ‑
200 nm，以满足富集收集系统中的培养基（26）自由通过而截留流体中的EVs，实现EVs的动态富集。...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，彭家伟，梁辉，周诚，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：