一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术公开的一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法，利用OverlapPCR方法连接基因L7/L12和GroES，利用pcDNA3.1构建真核表达载体pcDNA3.1

【技术实现步骤摘要】
一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染病，给牛羊养殖业造成了巨大经济损失，同时严重威胁人类健康。疫苗免疫是预防布鲁氏菌病较为有效的方法，商品化的布鲁氏菌疫苗有A19、S2、Rev1、M5和RB51等，均为弱毒疫苗，但是存在安全性不足的缺点，例如A19可导致怀孕动物流产，并存在排毒风险，且大都能够感染人并引起一过性疾病。DNA疫苗安全性高，且现有研究显示某些基因能够刺激机体产生较强的保护力，逐渐得到人们的重视。
[0003]基于布鲁氏菌L7/L12基因的DNA疫苗在能够产生良好的保护作用。GroES是热休克蛋白hsp60家族的辅助蛋白，可以激活宿主免疫反应，同时参与抗原呈递，增强宿主免疫应答水平。
[0004]因此，提供一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法，具体步骤如下：
[0008](1)提取B.abortus 2308基因组DNA；r/>[0009](2)利用引物LG
‑
1和LG
‑
2 PCR扩增L7/L12基因，LG
‑
3和LG
‑
4 PCR扩增GroES基因；扩增产物纯化后1：1混匀作为重叠PCR的模板，以引物LG1和LG4进行扩增，将L7/L12和GroES两个基因连接，获得L7/L12
‑
GroES；
[0010]其中，LG
‑
1和LG
‑
2以及LG
‑
3和LG
‑
4的引物序列如下：
[0011]LG
‑
1：5
’‑
GCGGATCCACCATGGTGGCTGATCTCGCAAAGATCGTT
‑3’
；SEQ ID NO.1；
[0012]LG
‑
2：5
’‑
GCGCTCGGGCAGTATCATCATTCCTCCCTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGCA
‑3’
；SEQ ID NO.2；
[0013]LG
‑
3：5
’‑
GGCGCCAAGGTTGAACTCAAGGGAGGAATGATGATACTGCCCGAGCGCCT
‑3’
；SEQ ID NO.3；
[0014]LG
‑
4：5
’‑
GCCTCGAGTCAGACAAGCGCATGTAGAGAAGCA
‑3’
；SEQ ID NO.4；
[0015](3)将纯化后的L7/L12
‑
GroES与质粒pcDNA3.1进行双酶切、连接和转化，涂布Amp平板培养过夜；挑取单菌落进行PCR鉴定，获得阳性克隆，提取质粒，经测序验证正确，获得
真核表达载体pcDNA3.1
‑
LG。
[0016]进一步，步骤(2)所述PCR和重叠PCR的反应体系为：上下游引物各1μL，DNA模板1μL，PCR Mixture 25μL，蒸馏水补齐50μL；反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 60s，50℃ 30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃终末延伸8min。
[0017]进一步，所述的一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。
[0018]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法及其应用，通过构建L7/L12和GroES的融合表达真核质粒，免疫小鼠后，机体产生了良好的体液和细胞免疫力，为布鲁氏菌核酸疫苗的开发奠定了重要基础。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0020]图1附图为本专利技术L7/L12和GroES基因PCR扩增及重叠PCR；
[0021]其中，M：DL2000 Plus DNA Marker；1：L7/L12；2：GroES；3：L7/L12
‑
GroES；
[0022]图2附图为本专利技术IPTG诱导重组蛋白表达后SDS
‑
PAGE分析；
[0023]其中，M：蛋白质预染Marker；1：重组质粒pET32a
‑
LG转化大肠杆菌感受态BL21；2：空载体pET32a转化大肠杆菌感受态BL21；
[0024]图3附图为本专利技术IPTG诱导重组蛋白表达后Western blot分析；
[0025]其中，1：重组质粒pET32a
‑
LG转化大肠杆菌感受态BL21；2：空载体pET32a转化大肠杆菌感受态BL21；
[0026]图4附图为本专利技术重组蛋白表达形式的SDS
‑
PAGE分析；
[0027]其中，M：蛋白质预染Marker；1：全菌；2：沉淀；3：上清；
[0028]图5附图为本专利技术重组蛋白纯化前后的SDS
‑
PAGE分析；
[0029]其中，M：蛋白质预染Marker；1：包涵体；2：包涵体纯化后；
[0030]图6附图为本专利技术多克隆抗体的Western blot验证；
[0031]其中，1：pET32a
‑
LG；2：pET32a；
[0032]图7附图为本专利技术间接免疫荧光验证重组蛋白在293T细胞中的表达；
[0033]图8附图为本专利技术Western blot验证重组蛋白在293T细胞中的表达；
[0034]其中，1：pcDNA3.1
‑
LG；2：pcDNA3.1；
[0035]图9附图为本专利技术ELISA方法测定免疫小鼠血清抗体水平；*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；
[0036]图10附图为本专利技术淋巴细胞转化试验测定细胞免疫水平(MTT法)；**：p<0.01；***：p<0.001。
具体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种布鲁氏菌L7/L12和GroES真核表达载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)提取B.abortus 2308基因组DNA；(2)利用引物LG
‑
1和LG
‑
2PCR扩增L7/L12基因，LG
‑
3和LG
‑
4PCR扩增GroES基因；扩增产物纯化后1：1混匀作为重叠PCR的模板，以引物LG1和LG4进行扩增，将L7/L12和GroES两个基因连接，获得L7/L12
‑
GroES；其中，LG
‑
1和LG
‑
2以及LG
‑
3和LG
‑
4的引物序列如下：LG
‑
1：5
’‑
GCGGATCCACCATGGTGGCTGATCTCGCAAAGATCGTT
‑3’
；SEQ ID NO.1；LG
‑
2：5
’‑
GCGCTCGGGCAGTATCATCATTCCTCCCTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGCA
‑3’
；SEQ ID NO.2；LG<...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴同垒，肖丽荣，史秋梅，张志强，周诗淼，冀梦瑶，
申请(专利权)人：河北科技师范学院，
类型：发明
国别省市：