一种β-半乳糖苷酶GalNC3-89及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种β

【技术实现步骤摘要】
一种
β
‑
半乳糖苷酶GalNC3
‑
89及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种β
‑
半乳糖苷酶GalNC3
‑
89及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]β
‑
半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)能够催化乳糖水解生成半乳糖和葡萄糖；其次该酶具有将乳糖催化形成低聚半乳糖的转糖基活性。乳糖是一种二糖，在哺乳动物的乳汁中含量丰富，对新生儿的营养至关重要；可被肠道中的乳糖酶水解成可吸收的葡萄糖和半乳糖。耐盐β
‑
半乳糖苷酶在高盐浓度中具有较高的酶活，在高盐工艺的食品工业中消化植物多糖。此外，还可合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因。GOS由β
‑
半乳糖苷酶通过乳糖水解过程中的转糖基化活性产生的，为食品中不可消化的益生元的成分，对人体健康至关重要，且酶法制备GOS具有简单、高效、量大、副反应较少等优势。
[0003]目前主要采取β
‑
半乳糖苷酶水解乳糖的方法制备GOS。GOS具有促进益生菌增殖预防和治疗便秘等功能；其次，在食品工业中用作发酵乳产品、面包和饮料等低热量甜味剂；在婴幼儿配方奶粉、烘焙食品和宠物食品等诸多领域有着广泛的应用。此外，可解决乳糖不耐的问题。此外，在酸性条件下可于室温下长时间保存并应用于各种产品而不会分解，故其在乳清和牛奶加工市场应用前景非常广阔。因此开发多功能的β
‑
半乳糖苷酶具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种β
‑
半乳糖苷酶GalNC3
‑
89及其制备方法和应用，同时还提供了该水解酶的构建方法，本专利技术β
‑
半乳糖苷酶GalNC3
‑
89具有良好的耐盐特性、温度稳定性及pH稳定性，高效转糖基活性和高效水解乳糖活性。
[0005]为了实现上述技术目的，本专利技术具体采用以下技术方案：
[0006]一种β
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半乳糖苷酶GalNC3
‑
89，所述β
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半乳糖苷酶GalNC3
‑
89来源于动物粪便宏基因组，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，共827个氨基酸，理论分子量为91.50kDa。
[0007]所述β
‑
半乳糖苷酶最适作用pH为6.5，在pH 5.0至pH 9.0下处理1h，其剩余酶活均在70％以上；最适作用温度为40℃，在37℃、40℃下分别处理1h，酶活性均在90％以上；该酶具有较好的NaCl稳定性，在0.5
‑
2.0mol/L NaCl下均保持100％以上酶活性；即使在2.5
‑
5.0mol/L NaCl下的酶活性也能维持在55％
‑
99％。
[0008]在本专利技术的另一方面，提供了所述β
‑
半乳糖苷酶GalNC3
‑
89的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，基因大小为2484bp。
[0009]在本专利技术的另一方面，提供了包含所述β
‑
半乳糖苷酶GalNC3
‑
89编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为pEASY
‑
E2/GalNC3
‑
89。
[0010]在本专利技术的另一方面，提供了包含所述β
‑
半乳糖苷酶GalNC3
‑
89编码基因重组菌株，所述菌株包括但不限于大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21
(DE3)/GalNC3
‑
89。
[0011]本专利技术通过PCR的方法克隆到β
‑
半乳糖苷酶GalNC3
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89编码基因，将该编码基因与质粒pEASY
‑
E2连接得到重组表达载体，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌。
[0012]在本专利技术的另一方面，提供了所述β
‑
半乳糖苷酶GalNC3
‑
89的制备方法，包括以下步骤：
[0013]1)以西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组DNA为模板，设计引物F和R进行PCR扩增，得到β
‑
半乳糖苷酶基因；
[0014]2)将β
‑
半乳糖苷酶基因与表达载体重组后转化到宿主细胞，得到重组菌株，培养重组菌株并诱导重组β
‑
半乳糖苷酶表达；
[0015]3)回收并纯化所表达的β
‑
半乳糖苷酶，得到β
‑
半乳糖苷酶GalNC3
‑
89。
[0016]所述引物F和R核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示。
[0017]在本专利技术的另一方面，提供了所述β
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半乳糖苷酶GalNC3
‑
89在食品加工、生产生物乙醇和制备工业乳制品中的应用。
[0018]在食品加工过程中，本专利技术β
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半乳糖苷酶GalNC3
‑
89可用于高盐工艺来消化植物多糖、合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因；在化工工艺中，可利用水解乳糖后的单糖来生产生物乙醇；在工业乳制品中，解决生产过程中产生的过多乳清带来环境污染的问题；此外，在乳制品行业中，用来生产低乳糖牛奶。
[0019]本专利技术的有益效果为：
[0020]本专利技术所述β
‑
半乳糖苷酶最适作用pH为6.5，在pH 5.0至pH 9.0下处理1h，其剩余酶活均在70％以上；最适作用温度为40℃，在37℃、40℃下分别处理1h，酶活性均在90％以上；该酶具有较好的NaCl稳定性，在0.5
‑
2.0mol/L NaCl下均保持100％以上酶活性；即使在2.5
‑
5.0mol/L NaCl下的酶活性也能维持在55％
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99％。该酶的Km、和Vmax分别为1.935mmol/L和0.8948mmol/min；Na
+
、Fe
3+
、Pb
2+
、Tween80和TritonX
‑
100对GalNC3
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89有激活作用，分别将酶活性提高10％、14％、28％、31％和9％；其余金属离子和化学试剂均不同程度抑制其活性。以上性质表明，本专利技术制备的β
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半乳糖苷酶在食品工业、合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因等具有较好的应用潜力。其次，该β
‑
半乳糖苷酶可有效地利用水解乳糖后的单糖生产生物乙醇，解决工业乳制品生产过程中产生的过多乳清带来环境污染的问题；此外，在乳制品行业中可用来生产低乳糖牛奶具有较好的应用前景。
附图说明...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
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半乳糖苷酶GalNC3
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89，其特征在于，所述β
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半乳糖苷酶GalNC3
‑
89氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述β
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半乳糖苷酶GalNC3
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89的编码基因，其特征在于，所述编码基因如SEQ ID NO.2所示。3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。5.权利要求1所述β
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半乳糖苷酶GalNC3
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89的制备方法，其特征在于，包括以下...

【专利技术属性】
技术研发人员：许波，范琴，黄遵锡，唐湘华，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：