一株须糖多孢菌ΔClu13-MmsA及其构建方法与应用技术

一株须糖多孢菌ΔClu13

【技术实现步骤摘要】
一株须糖多孢菌
Δ
Clu13
‑
MmsA及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及一株须糖多孢菌菌株及其构建方法与应用，尤其涉及一株高产丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌ΔClu13
‑
MmsA及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]农作物虫害是我国现代农业可持续发展的主要障碍之一。传统化学农药能抵御害虫的侵袭，但是其易残留，会对环境造成污染和破坏，同时产生食品安全问题。生物农药因其选择性强、无毒无害、不易产生抗性等优点，逐渐被得以重视。随着人们的生态环境和食品安全意识的提高，对环境和农作物安全的绿色生物农药需求也不断增长。
[0003]丁烯基多杀菌素(butenyl
‑
spinosyn)，是由须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)经好氧发酵产生的，是触杀及摄食毒素的新型微生物源杀虫剂，具有比多杀菌素更为广泛的杀虫谱，对水果类害虫的控制更为明显，是当今世界上最具发展前景的新型生物农药之一。虽然，丁烯基多杀菌素杀虫效果显著，但野生型菌株丁烯基多杀菌素产量低、质量不稳定、发酵周期长，严重制约了丁烯基多杀菌素的生产和应用。因此，如何提高丁烯基多杀菌素产量以及缩短发酵周期成为科学攻关研究的热点课题。
[0004]2018年，Li等人首次通过基因工程技术完成对须糖多孢菌聚核苷酸磷酸激酶基因(pnp)研究，并获得高产突变株，使得利用基因工程技术对须糖多孢菌基因组进行定向遗传修饰成为了提高丁烯基多杀菌素产量的有效方法(参见“Li L,Rang J,He H,et al.Impact on strain growth and butenyl
‑
spinosyn biosynthesis by overexpression of polynucleotide phosphorylase gene in Saccharopolyspora pogona.Appl Microbiol Biotechnol.2018Sep；102(18):8011
‑
8021”)。随后，为了构建高产丁烯基多杀菌素工程菌株，科研人员进行了广泛的研究，包括双组份系统SenX3
‑
RegX3(参见“Rang J,He H,Chen J,et al.SenX3
‑
RegX3,an Important Two
‑
Component System,Regulates Strain Growth and Butenyl
‑
spinosyn Biosynthesis in Saccharopolyspora pogona.iScience.2020；23(8):101398”)，TetR家族调控因子(参见“He H,Yuan S,Hu J,et al.Effect of the TetR family transcriptional regulator Sp1418 on the global metabolic network of Saccharopolyspora pogona.Microb Cell Fact.2020；19(1):27”)，GDP
‑
岩藻糖合成酶(参见“彭胜男,何昊城,苑爽芹等.fcl基因对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成及生长发育的影响.生物工程学报,2019,35(09):1662
‑
1675”)以及其它聚酮化合物基因簇(参见“Rang J,Li Y,Cao L,et al.Deletion of a hybrid NRPS
‑
T1PKS biosynthetic gene cluster via Latour gene knockout system in Saccharopolyspora pogona and its effect on butenyl
‑
spinosyn biosynthesis and growth development.Microb Biotechnol.2020；published online”)，但仍未取得显著的突破，现有须糖多孢菌工程菌株的丁烯基多杀菌素的产量仍旧不够令人满意。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株高产丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌工程菌株。
[0006]本专利技术进一步要解决的技术问题是，提供一株高产丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌工程菌株的构建方法。
[0007]本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是，一株须糖多孢菌ΔClu13
‑
MmsA(Saccharopolyspora pogonaΔClu13
‑
MmsA)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021825。
[0008]进一步，所述须糖多孢菌ΔClu13
‑
MmsA，是在敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌中，插入强启动子过表达丙二酸半醛脱氢酶基因mmsA获得的。
[0009]进一步，所述强启动子为P
kasO
，其序列如SEQ ID No.5所示。
[0010]进一步，所述丙二酸半醛脱氢酶基因mmsA来自基因组上编号为orf3916的须糖多孢菌基因组，其序列如SEQ ID No.1所示。
[0011]本专利技术进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一株须糖多孢菌ΔClu13
‑
MmsA的构建方法，包括下列步骤：
[0012](1)提取须糖多孢菌NRRL 30141基因组，确定mmsA基因前非编码区，在mmsA基因前非编码区上下游分别扩增同源臂，分别得上游同源臂和下游同源臂；
[0013](2)提取pKCcas9dO质粒和pUC57
‑
Amp
‑
P
kasO
质粒，用pKCcas9dO质粒为模板，以sgRNA
‑
F
mmsA
/sgRNA
‑
R
mmsA
为引物对扩增sgRNA序列，用pUC57
‑
Amp
‑
P
kasO
质粒作为模板，以P
kasO
‑
F
mmsA
/P
kasO
‑
R
mmsA
作为引物对扩增强启动子P
kasO
；
[0014](3)将扩增后的sgRNA、上游同源臂、扩增后的强启动子P
kasO
和下游同源臂依次相连，然后与质粒pKCcas9进行同源重组，得重组质粒pKCcas9dO
‑
sgRNA
‑
UHA
‑
P
kasO
‑
DHA；
[0015](4)将步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株须糖多孢菌ΔClu13
‑
MmsA，其特征在于，所述须糖多孢菌ΔClu13
‑
MmsA(Saccharopolyspora pogonaΔClu13
‑
MmsA)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021825。2.根据权利要求1所述的须糖多孢菌ΔClu13
‑
MmsA，其特征在于，所述须糖多孢菌ΔClu13
‑
MmsA是在敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌中，插入强启动子过表达丙二酸半醛脱氢酶基因mmsA获得的。3.根据权利要求2所述的须糖多孢菌ΔClu13
‑
MmsA，其特征在于，所述强启动子为P
kasO
，其序列如SEQ ID No.5所示。4.根据权利要求2或3所述的须糖多孢菌ΔClu13
‑
MmsA，其特征在于，所述丙二酸半醛脱氢酶基因mmsA来自基因组上编号为orf3916的须糖多孢菌基因组，其序列如SEQ ID No.1所示。5.一种如权利要求1～4之一所述的须糖多孢菌ΔClu13
‑
MmsA的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)提取须糖多孢菌NRRL 30141基因组，确定mmsA基因前非编码区，在mmsA基因前非编码区上下游分别扩增同源臂，分别得上游同源臂和下游同源臂；(2)提取pKCcas9dO质粒和pUC57
‑
Amp
‑
P
kasO
质粒，用pKCcas9dO质粒为模板，以sgRNA
‑
F
mmsA
/sgRNA
‑
R
mmsA
为引物对扩增sgRNA序列，用pUC57
‑
Amp
‑
P
kasO
质粒作为模板，以P
kasO
‑
F
mmsA
/P
kasO
‑
R
mmsA
...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏立秋，何昊城，丁学知，穰杰，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：