一种植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法技术

本发明专利技术涉及植物细胞分离技术，旨在提供一种植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法。包括：将不包含叶脉且撕去表皮的叶片剩余部分切成小块，浸没于酶液中进行酶解，过滤酶液收集滤液；取蔗糖溶液置于试管中，沿管壁添加Percoll溶液并形成明显分层；将步骤滤液添加至上层后离心处理，缓慢取出保持分层；最上层的无色溶液层，即为表皮细胞所在层。本发明专利技术利用梯度分离方法能够快速获得纯净的表皮细胞，避免了去除细胞碎片等杂质的操作。因而操作过程简单，能大大提升植物表皮细胞原生质体的制备效率。无需使用价格高昂的带水平转子的离心机，只需要带角转子的离心机就可以实现表皮和叶肉原生质体的分离。叶肉原生质体的分离。叶肉原生质体的分离。

【技术实现步骤摘要】
一种植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法


[0001]本专利技术属于植物细胞分离技术，尤其涉及植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法。

技术介绍

[0002]目前植物叶片表皮原生质体的分离方法，一般是将叶片切成小段或撕去下表皮后，连带着叶肉一起酶解。但是，拟南芥、烟草、番茄等植物的叶片中叶肉细胞占绝大部分，需要根据表皮细胞原生质体相比于叶肉细胞原生质体重量轻的特点，采用密度梯度离心的方法分离叶肉和表皮细胞。但由于存在部分细胞碎片等杂质的原因，容易造成表皮细胞原生质体获取不纯的问题。同时在常规梯度离心时对于离心机的转子类型具有较高的要求，需要带水平转子的离心机。但由于设备价格差别，目前普通的植物研究实验室大多只配备带角转子的离心机。因此，在采用常规分离方法和角转子离心机分离表皮和叶肉原生质体时，会使大部分细胞先离心堆叠至管壁上，原生质体挤压破损，导致大量表皮原生质体丢失。

技术实现思路

[0003]本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法。
[0004]为解决技术问题，本专利技术的解决方案是：
[0005]提供一种植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法，包括以下步骤：
[0006](1)取植物叶片，顺着叶脉撕去叶片下表皮，将不包含叶脉且撕去表皮的叶片剩余部分切成小块；
[0007](2)将小块叶片全部浸没于酶液中，在恒温摇床中进行酶解；控制酶解条件为：25～27℃、60rpm/min，1.5～2h；酶解完成后，吹打酶液使粘黏的表皮细胞分离；过滤酶液，收集滤液；
[0008](3)构建梯度分离液：取适量2.5M/L的蔗糖溶液置于试管中，沿管壁添加60％的Percoll溶液并形成明显分层；
[0009](4)将步骤(2)中的滤液添加至步骤(3)中梯度分离液的上层，将试管置于离心机中离心处理；离心完成后缓慢取出，不能剧烈晃动，保持试管中的明显分层；其中最上层的无色溶液层，即为表皮细胞所在层；
[0010](5)取表皮细胞所在层的适量液体，置于显微镜下观察表皮细胞情况；如仍存在少量叶肉原生质体或碎片，则重复步骤(4)的操作。
[0011]本专利技术中，所述步骤(1)中的植物叶片是幼嫩叶片或成熟叶片。
[0012]本专利技术中，所述步骤(2)中，酶液的配置过程如下：称取0.011g 2
‑
吗啉乙磺酸一水合物(MES)溶于10ml去离子水中，以1M/L KOH调pH至5.7；然后加入0.855g蔗糖、0.2g纤维素酶、0.02g果胶酶和0.1g离析酶，混匀溶解，得到酶液。
[0013]本专利技术中，所述步骤(3)中，60％Percoll溶液的配置过程如下：称取0.0044g 2
‑
吗啉乙磺酸一水合物(MES)溶于4ml去离子水中，以1M/L KOH调pH至5.7；加入0.342g蔗糖，混匀溶解；再加入6ml Percoll混悬液混匀，得到60％Percoll溶液。
[0014]本专利技术中，所述步骤(4)中，离心处理的条件为：1000g，5～10min。
[0015]本专利技术中，在添加Percoll溶液和滤液时，使用巴斯德滴管或移液枪沿管壁添加，控制添加速度以保证形成分层。
[0016]专利技术原理描述：
[0017]在植物表皮原生质体过程中，酶液中包含表皮细胞原生质体、细胞碎片和较重的叶肉细胞原生质体。本专利技术利用植物表皮细胞原生质体质量较轻的特点，通过结合Percoll和蔗糖两种溶液来构建分离梯度，进行叶片表皮细胞与叶肉细胞及碎片的分离。一方面可以简单快速获取大量纯净的植物表皮细胞(细胞碎片少)，表皮原生质体漂浮在Percoll溶液层中，不与蔗糖溶液接触，减少细胞原生质体的破损；另一方面，通过采用高浓度的Percoll溶液使得表皮细胞向管壁移动的速度极大的减缓，故减少了表皮原生质体离心堆叠至管壁的可能性，增加表皮原生质体的收集率。因此该方法对离心机要求不高，完全适用于只有角转子的离心机。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0019]1、针对叶肉细胞含量相对较多的植物叶片，本专利技术利用梯度分离方法能够快速获得纯净的表皮细胞，避免了去除细胞碎片等杂质的操作。因而操作过程简单，能大大提升植物表皮细胞原生质体的制备效率。
[0020]2、本专利技术无需使用价格高昂的带水平转子的离心机，只需要带角转子的离心机就可以实现表皮和叶肉原生质体的分离。
附图说明
[0021]图1为烟草叶片酶解前后对比照片。
[0022]图2为本专利技术中的梯度分离示意图。
[0023]图3为分离后的烟草叶片表皮表皮单细胞原生质体照片。
具体实施方式
[0024]本专利技术针对植物叶片组织进行酶解后，进一步构建Percoll/蔗糖梯度，结合离心获取叶片表皮原生质体悬液。在构建分离梯度后，只需使用角转子离心机进行离心，即可获得大量表皮细胞，带有水平转子的离心机同样适用于该方法离心。
[0025]经离心处理后，蔗糖溶液位于最下层，Percoll溶液位于蔗糖溶液之上，原生质体混悬液位于最上层(即在Percoll溶液层之上)。对于单次分离得到的叶片表皮原生质体悬液中杂质较多现象，可以通过重复Percoll/蔗糖梯度分离步骤，进而纯化叶片表皮原生质体。
[0026]最上层的叶片表皮原生质体悬液具有如下特征：悬液中叶片表皮原生质体数量多；叶片表皮原生质体悬液中叶肉细胞、叶肉细胞内容物、叶绿体等杂质少；悬液中叶片表皮原生质体活性高。
[0027]下面结合具体实施例子，对本专利技术的具体实现方式进行详细表述。
[0028]实施例1
[0029]以烟草叶片为例，本专利技术所述高效制备植物表皮细胞原生质体的方法包括以下步骤：
[0030](1)收集5g烟草叶片，幼嫩叶片或成熟叶片均可，但需保证下表皮能够较好撕取；使用尖镊子顺着叶脉撕去叶片下表皮后，将不包含叶脉的撕去表皮的叶片剩余部分切成小块；
[0031](2)将小块叶片全部置于10ml酶液中，置于恒温摇床中酶解；控制酶解的条件为：25℃，60rpm/min，酶解2h，酶解前后对比如图1所示。
[0032]酶液的配置过程如下：称取0.011g 2
‑
吗啉乙磺酸一水合物(MES)溶于10ml去离子水中，以1M/L KOH调pH至5.7；然后加入0.855g蔗糖、0.2g纤维素酶、0.02g果胶酶和0.1g离析酶，混匀溶解，得到酶液。
[0033]酶解时需保证叶片全部浸没于酶液中，可使用镊子辅助；酶解完成后，使用巴斯德滴管轻轻吹打酶液，使一些仍粘黏的表皮细胞分离；酶液使用Faclon 40um过滤器过滤，收集滤液；
[0034](3)构建梯度分离液：
[0035]首先取适量2.5M/L的蔗糖溶液置于试管最下层，然后采用巴斯德滴管沿管壁缓慢添加60％Percoll溶液并形成明显分层；即，梯度分离液的下层溶液为2.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物叶片表皮单细胞原生质体高效获取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取植物叶片，顺着叶脉撕去叶片下表皮，将不包含叶脉且撕去表皮的叶片剩余部分切成小块；(2)将小块叶片全部浸没于酶液中，在恒温摇床中进行酶解；控制酶解条件为：25～27℃、60rpm/min，1.5～2h；酶解完成后，吹打酶液使粘黏的表皮细胞分离；过滤酶液，收集滤液；(3)构建梯度分离液：取适量2.5M/L的蔗糖溶液置于试管中，沿管壁添加60％的Percoll溶液并形成明显分层；(4)将步骤(2)中的滤液添加至步骤(3)中梯度分离液的上层，将试管置于离心机中离心处理；离心完成后缓慢取出，不能剧烈晃动，保持试管中的明显分层；其中最上层的无色溶液层，即为表皮细胞所在层；(5)取表皮细胞所在层的适量液体，置于显微镜下观察表皮细胞情况；如仍存在少量叶肉原生质体或碎片，则重复步骤(4)的操作。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的植物叶片是幼嫩叶片或成熟叶片。3.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊龙江，陈洪瑜，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：