使用加标签的向导RNA构建体进行高效基因筛选的组合物和方法技术

本发明专利技术提供了使用一组或多组具有内部标签(“iBAR”)的向导RNA构建体进行基因筛选的组合物、试剂盒和方法。每组具有三个或更多个靶向相同基因组基因座的向导RNA构建体，但嵌入有不同的iBAR序列。有不同的iBAR序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用加标签的向导RNA构建体进行高效基因筛选的组合物和方法


[0001]本专利技术涉及使用具有内部标签(“iBAR”)的向导RNA构建体进行基因筛选的组合物，试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9系统实现了以高的效率和特异性在靶标基因组位点上进行编辑1‑2。其为数众多的用途之一是通过将混合高通量混池测序与二代测序(“NGS”)分析相结合来鉴定编码基因、非编码RNA和调节元件的功能。通过将混合的单向导RNA(“sgRNA”)或成对的向导RNA(“pgRNA”)文库引入至表达Cas9或者与效应子结构域融合的无催化活性的Cas9(dCas9)的细胞，研究人员可以通过产生不同突变、大的基因组缺失、转录激活或转录抑制来实施多种基因筛选。
[0003]为了产生高质量的gRNA细胞文库以用于给定的混合性CRISPR筛选，须在细胞文库构建期间使用低感染复数(“MOI”)来确保每个细胞平均纳入少于1个sgRNA或pgRNA以使该筛选的假阳性率(FDR)
6,10,11
最小化。为了进一步降低FDR并提高数据重现性，通常需要深度覆盖的gRNA和多个生物学重复以获得带有高统计学意义的命中基因，这会导致工作量增加。当实施大量的全基因组筛选时，当用于文库构建的细胞材料有限时，或者当进行更具挑战性的筛选(例如体内筛选)时会出现更多困难，因为这些情况下均难以获得实验重复或控制MOI。用于在真核细胞中大规模鉴定靶标的可靠且高效的筛选策略仍旧是迫切需要。
[0004]本文提及的所有出版物、专利、专利申请和已公开的专利申请的披露均通过引用整体并入本文。

技术实现思路

[0005]本申请提供了用于通过CRISPR
‑
Cas基因编辑系统进行基因筛选的向导RNA构建体、文库、组合物和试剂盒，以及基因筛选的方法。
[0006]本申请的一个方面提供了一种sgRNA
iBAR
构建体组，其包含三个或更多个(例如四个)sgRNA
iBAR
构建体，每个构建体包含或编码一个sgRNA
iBAR
，其中每条sgRNA
iBAR
都具有包含向导序列和内部标签(“iBAR“)序列的sgRNA
iBAR
序列，其中每个向导序列与靶标基因组基因座互补，其中三个或更多个sgRNA
iBAR
构建体的向导序列是相同的，其中三个或更多个sgRNA
iBAR
构建体中每条sgRNA
iBAR
的iBAR序列是彼此不同的。并且其中每条sgRNA
iBAR
可与Cas蛋白合作以修饰靶标基因组基因座。在一些实施方案中，每条iBAR序列包含约1
‑
50个核苷酸，例如约2
‑
20个核苷酸或约3
‑
10个核苷酸。在一些实施方案中，每个向导序列包含约17
‑
23个核苷酸。
[0007]在根据上述任一sgRNA
iBAR
构建体组的一些实施方案中，其中每条sgRNA
iBAR
序列包含第一茎序列和第二茎序列，其中第一茎序列与第二茎序列杂交以形成与Cas蛋白相互作用的双链RNA区，并且其中iBAR序列位于第一茎序列和第二茎序列之间。在根据上述任一组
sgRNA
iBAR
构建体的一些实施方案中，其中每条sgRNA
iBAR
序列在5'至3'方向上包含第一茎序列和第二茎序列，其中第一茎序列与第二茎序列杂交形成与Cas蛋白相互作用的双链RNA区，并且其中iBAR序列位于第一茎序列的3'末端和第二茎序列的5'末端之间。
[0008]在根据上述任一sgRNA
iBAR
构建体组的一些实施方案中，Cas蛋白是Cas9。在一些实施方案中，每条sgRNA
iBAR
序列包含与第二序列融合的向导序列，其中第二序列包含与Cas9相互作用的重复
‑
反向
‑
重复茎环。在一些实施方案中，每条sgRNA
iBAR
序列的iBAR序列位于重复
‑
反向
‑
重复茎环的环状区域中。在一些实施方案中，将每条sgRNA
iBAR
序列的iBAR序列插入重复
‑
反向
‑
重复茎环的环状区域中。在一些实施方案中，每条sgRNA
iBAR
序列的第二序列还包含茎环1、茎环2和/或茎环3。在一些实施方案中，每条sgRNA
iBAR
序列的iBAR序列位于茎环1、茎环2或茎环3的环状区域中。在一些实施方案中，每条sgRNA
iBAR
序列的iBAR序列插入茎环1、茎环2或茎环3的环状区域中。
[0009]在根据上述任一sgRNA
iBAR
构建体组的一些实施方案中，每个sgRNA
iBAR
构建体是质粒。在一些实施方案中，每个sgRNA
iBAR
构建体是病毒载体，例如慢病毒载体。
[0010]本申请的一个方面提供了sgRNA
iBAR
文库，其包含根据上述任一sgRNA
iBAR
构建体组的多个sgRNA
iBAR
构建体组，其中每个sgRNA
iBAR
构建体组对应与不同靶标基因组基因座互补的向导序列。在一些实施方案中，sgRNA
iBAR
文库包含至少约1000(例如至少约2000、5000、10000、15000、20000或更多)个sgRNA
iBAR
构建体组。在一些实施方案中，至少两个sgRNA
iBAR
组构建体的iBAR序列是相同的。在一些实施方案中，不同的sgRNA
iBAR
构建体组具有不同的iBAR序列组合。
[0011]本申请的一个方面提供了制备包含多个sgRNA
iBAR
构建体组的sgRNA
iBAR
文库的方法，其中每个组对应多个向导序列中的一个，每个向导序列与不同的靶标基因组基因座互补，其中所述方法包括：a)为每个向导序列设计三个或更多(例如四个)sgRNA
iBAR
构建体，其中每个sgRNA
iBAR
构建体包含或编码具有包含相应向导序列和iBAR序列的sgRNA
iBAR
序列的sgRNA
iBAR
，其中对应于三个或更多个sgRNA
iBAR
构建体中每个sgRNA
iBAR
构建体的iBAR序列彼此不同，并且其中每条sgRNA
iBAR
可与Cas蛋白合作以修饰相应的靶标基因组基因座；b)合成每个sgRNA
iBAR
构建体，从而产生sgRNA
iBAR
文库。在一些本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.sgRNA
iBAR
构建体组，其包含三个或更多个sgRNA
iBAR
构建体，每个构建体包含或编码sgRNA
iBAR
，其中每条sgRNA
iBAR
具有包含向导序列和内部标签(iBAR)序列的sgRNA
iBAR
序列，其中每个向导序列与一个靶基因组基因座互补，其中三个或更多个sgRNA
iBAR
构建体的向导序列是相同的，其中这三个或更多个sgRNA
iBAR
构建体各自的iBAR序列彼此不同，并且其中每条sgRNA
iBAR
可与Cas蛋白合作以修饰靶基因组基因座。2.根据权利要求1所述的sgRNA
iBAR
构建体组，其中每条sgRNA
iBAR
序列包含第一茎序列和第二茎序列，其中第一茎序列与第二茎序列杂交以形成与Cas蛋白相互作用的双链RNA区域，并且其中iBAR序列位于第一茎序列和第二茎序列之间。3.根据权利要求1或2所述的sgRNA
iBAR
构建体组，其中所述Cas蛋白是Cas9。4.根据权利要求3所述的sgRNA
iBAR
构建体组，其中每条sgRNA
iBAR
序列包含与第二序列融合的向导序列，其中第二序列包含与Cas9相互作用的重复
‑
反向
‑
重复茎环。5.根据权利要求4所述的sgRNA
iBAR
构建体组，其中每条sgRNA
iBAR
序列的iBAR序列位于重复
‑
反向
‑
重复茎环的环状区域中。6.根据权利要求4或5所述的sgRNA
iBAR
构建体组，其中每条sgRNA
iBAR
序列的第二序列还包含茎环1、茎环2和/或茎环3。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的sgRNA
iBAR
构建体组，其中每条iBAR序列包含约1
‑
50个核苷酸。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的sgRNA
iBAR
构建体组，其中每个向导序列包含约17
‑
23个核苷酸。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的sgRNA
iBAR
构建体组，其中每个sgRNA
iBAR
构建体是一个质粒。10.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的sgRNA
iBAR
构建体组，其中每个sgRNA
iBAR
构建体是一个病毒载体。11.根据权利要求10所述的sgRNA
iBAR
构建体组，其中病毒载体是慢病毒载体。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的sgRNA
iBAR
构建体组，其包含四种sgRNA
iBAR
构建体，其中所述四种sgRNA
iBAR
构建体中的每种的iBAR序列彼此不同。13.一种sgRNA
iBAR
文库，其包含多组根据权利要求1
‑
12中任一项的sgRNA
iBAR
构建体组，其中每个sgRNA
iBAR
构建体组对应与不同靶基因组基因座互补的向导序列。14.根据权利要求13所述的sgRNA
iBAR
文库，其包含至少约1000个sgRNA
iBAR
构建体组。15.根据权利要求13或14所述的sgRNA
iBAR
文库，其中至少两个sgRNA
iBAR
构建体组的iBAR序列是相同的。16.一种制备包含多个sgRNA
iBAR
构建体组的sgRNA
iBAR
文库的方法，其中每个sgRNA
iBAR
构建体组对应与不同靶基因组基因座互补的多个向导序列中的一个，其中所述方法包括：a)为每个向导序列设计三个或更多个sgRNA
iBAR
构建体，其中每个sgRNA
iBAR
构建体包含或编码具有包含相应向导序列和iBAR序列的sgRNA
iBAR
序列的sgRNA
iBAR
，其中对应所述三个或更多个sgRNA
iBAR
构建体中的每种sgRNA
iBAR
构建体的iBAR序列彼此不同，并且其中每个sgRNA
iBAR
可与Cas蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏文胜，朱诗优，曹中正，刘志恒，何苑，袁鹏飞，
申请(专利权)人：博雅缉因北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：