一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法，其包括使染色体上编码α-酮戊二酸脱氢酶复合物的Elo亚基的odhA基因的调控区发生突变和/或缺失。本发明专利技术的方法能够将L-脯氨酸生产菌的L-脯氨酸生产能力提高至少3倍，构建的工程菌CCTCC NO:M 2020060在发酵生产L-脯氨酸的产量高达119.90g/L，具有工业应用前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
V.F.Wendisch,Microbial Cell Factories,2013.12.)。Zhang,Y.等人以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，从头通过理性设计将G446A点突变引入基因组的proB基因解除L-脯氨酸的反馈抑制，敲除(失活)脯氨酸脱氢酶(编码基因putA)阻断L-脯氨酸到谷氨酸的转化，替换顺头乌酸酶(编码基因acn)的启动子并将起始密码子从TTG更换为ATG增加α-酮戊二酸通路流量，使用质粒形式用Ptac启动子过表达proBG446A构建了一株L-脯氨酸高产菌株Pro-6，分批补料发酵60h产L-脯氨酸66.43g/L(Zhang,Y.,et al.,Biotechnol Biofuels,2017.10:p.169.)。Jiang Y.等人使用CRISPR介导的ssDNA重组工具对谷氨酸棒杆菌ATCC13032 ProB的G149位点进行饱和突变，筛选得到了一系列抗L-脯氨酸反馈抑制菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032ProBG149K，并证明ProB G149位点突变为赖氨酸K时效果最好，96孔板发酵L-脯氨酸产量达到6.6
±
1.0g/L(Jiang,Y.,et al.,CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum.Nature Communications,2017.8.)。
[0006]通过基因工程手段获得更高产量的L-脯氨酸生产菌株对于提高L-脯氨酸生产的效益具有重要意义。

技术实现思路

[0007]为了构建一株产量更高的L-脯氨酸生产菌株，本专利技术利用基因工程技术来改造谷氨酸棒杆菌，通过增强与L-脯氨酸生产相关的基因，弱化分支代谢途径，提高辅因子NADPH水平，获得一株高产L-脯氨酸的菌株ZQJY-9，从而提升了L-脯氨酸的生产能力，降低生产成本，具有广阔的工业化应用前景。基于相同的原理，上述方法还可以应用于其他氨基酸产生菌，以便提高其他氨基酸的生产能力。具体而言，本专利技术包括如下技术方案：
[0008]一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法，其包括下述步骤：使该氨基酸产生菌的染色体上编码α-酮戊二酸脱氢酶复合物的Elo亚基的odhA基因的调控区发生突变和/或缺失。
[0009]上述氨基酸选自L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸及其它L-谷氨酸衍生物。
[0010]上述氨基酸产生菌选自大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌、停滞棒杆菌、产氨棒杆菌等棒杆菌，优选是谷氨酸棒状杆菌，更优选是谷氨酸棒杆菌ATCC13032或其衍生菌株。
[0011]优选上述方法中，所述odhA基因的阅读框起始密码子之前第11至第15个碱基的核糖体结合RBS区域的碱基序列AGGCG被其它碱基序列取代。
[0012]上述的其它碱基序列选自下组：AGAGG、TGAGG、GGAGG、CGAGG、GAAGG。
[0013]在一种实施方式中，上述odhA基因的调控区发生缺失是指odhA基因的阅读框起始密码子之前的序列发生缺失，在3
’-
端包含起始密码子GTG的所述序列选自下组：
[0014]AATAAACCCTCAAGAAGCAAGGGAGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:1)；
[0015]AATAAACCCTCAAGAAGCAAGGTAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:2)；
[0016]AATAAACCCTCAAGAAGCAAGAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:3)；
[0017]AATAAACCCTCAAGAAGCAGAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:4)；
[0018]AATAAACCCTCAAGAAGCAAGAGAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:5)；
[0019]AATAAACCAGAAGCAAGGAAAAGAGGCGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:6)。
[0020]这些序列SEQ ID NOs:1-6在3
’-
端都包含有起始密码子GTG。
[0021]优选地，上述方法包括下述步骤：所述odhA基因的阅读框起始密码子之前的序列变成SEQ ID NO:2；并且使氨基酸产生菌的染色体上发生putA基因失活(例如基因全部或部分删除、或阅读框内突变终止密码子)；gnd*(S361F)和zwf*(A243T)基因突变；gdh基因强化(例如更换启动子或增加拷贝数)；avtA基因失活(例如基因全部或部分删除、或阅读框内突变终止密码子)；proB*(G149K)基因突变；proB*(G149K)基因以游离质粒pXMJ19表达，并置于组成型启动子Peftu后，例如以重组质粒pXMJ19-Peftu::ProBG149K表达，该重组质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO:7。
[0022]在一种实施方式中，上述putA基因失活是编码区第60位精氨酸突变为终止密码子；所述gdh基因强化是将天然启动子替换为强启动子Peftu；所述avtA基因失活是将编码区第63位亮氨酸突变为终止密码子。
[0023]上述方法尤其可用于L-脯氨酸生产菌的改造和基因工程菌构建。
[0024]具体来说，本专利技术提供了一种提高L-脯氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：
[0025]A.以L-脯氨酸产生菌为出发菌株，进行putA*(R60 stop codon(即编码区第60位精氨酸突变为终止密码子))、gnd*(S361F)和zwf*(A243T)基因突变，并将gdh的启动子更换为Peftu以使gdh基因过表达，获得gdh基因增强菌株；
[0026]B.失活步骤A中所得的gdh基因增强菌株中的基因avtA*(L63 stop codon(即编码区第63位亮氨酸突变为终止密码子))，获得avtA基因失活菌株；
[0027]C.调控步骤B中所得的avtA基因失活菌株中基因odhA的表达，获得odhA表达调控菌株；
[0028]D.构建包含过表达出发菌株中基因突变体proB*(G149K)的重组质粒pXMJ19-Peftu::ProBG149K，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7；
[0029]E.将步骤D中所述重组质粒转化到步骤C中所得的odhA表达调控菌株中，获得基因工程菌。
[0030]上述步骤A中的putA、gnd和zwf基因突变可以是其中一个基因突变、其中两个基因突变、或者三个基因同时突变。
[0031]上述步骤A的作用是增强L-脯氨酸产生菌比如谷氨酸棒杆菌的L-脯氨酸代谢途径中辅因子NADPH水平，阻断L-脯氨酸的降解，增加谷氨酸合成的通量，获得基因增强菌株。
[0032]上述步骤B的作用是降低L-脯氨酸代谢途径中的分支途径丙氨酸的合成。
[0033]上述步骤C的作用是微调代谢途本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法，其特征在于，包括下述步骤：使该氨基酸产生菌的染色体上编码α-酮戊二酸脱氢酶复合物的Elo亚基的odhA基因的调控区发生突变和/或缺失。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸选自L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸及其它L-谷氨酸衍生物。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述odhA基因的阅读框起始密码子之前第11至第15个碱基的核糖体结合RBS区域的碱基序列AGGCG被其它碱基序列取代。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述其它碱基序列选自下组：AGAGG、TGAGG、GGAGG、CGAGG、GAAGG。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述odhA基因的调控区发生突变和/或缺失是指odhA基因的阅读框起始密码子之前的序列发生突变和/或缺失，包含起始密码子GTG的所述序列选自下组：AATAAACCCTCAAGAAGCAAGGGAGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:1)；AATAAACCCTCAAGAAGCAAGGTAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:2)；AATAAACCCTCAAGAAGCAAGAGGAGTACCTGCCGTG(SEQ ID NO:3)；AATAAACCCTCAAGAAGCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱峰慧，董枫，张姣，蒋宇，杨晟，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：