牛早期胚胎性别鉴定的方法和所用的试剂技术

本发明专利技术涉及牛早期胚胎性别鉴定的方法和所用的试剂，该试剂的pH值为6.8~7.2且是照如下方式配制的：取磷酸氢二钾9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。本发明专利技术方法包括如下步骤：通过离体取卵或者在体取卵的方法获取卵卵母细胞，使卵母细胞和精子进行体外受精得到桑椹胚；将桑椹胚在分割液滴内用分割刀割取胚胎组织作为性别鉴定的样品；环介导等温扩增法性别鉴定试剂盒制作样品并配制Master Mix；待样品混合后使反应管置环介导等温扩增实时浊度检测系统中反应，根据结果确定胚胎样品的性别。本发明专利技术方法呈现如说明书所述优异技术效果，例如方法准确可靠，能够避免出现不确定的结果。能够避免出现不确定的结果。

【技术实现步骤摘要】
牛早期胚胎性别鉴定的方法和所用的试剂


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种性别鉴定的方法，尤其涉及一种牛早期胚胎性别鉴定的方法。特别是涉及一种使用环介导等温扩增法进行牛早期胚胎性别鉴定的方法。本专利技术还涉及使用环介导等温扩增法进行牛早期胚胎性别鉴定中所用的试剂。

技术介绍

[0002]畜牧业是利用畜禽等已经被人类驯化的动物，或者鹿、麝、狐、貂、水獭、鹌鹑等野生动物的生理机能，通过人工繁殖、饲养，使其将牧草和饲料等植物能转变为动物能，以取得肉、蛋、奶、羊毛、山羊绒、皮张、蚕丝和药材等畜产品的生产部门。区别于自给自足家畜饲养，畜牧业具有集中化、规模化的特点，已成为保障基本民生的支柱产业。
[0003]体外受精(In Vitro Fertilization)或(external fertilization)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。由于它与胚胎移植技术(ET)密不可分，又简称为IVF
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ET。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test
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tube animal)。这项技术成功于20世纪50年代，在最近20年发展迅速，现已日趋成熟而成为一项重要而常规的动物繁殖生物技术。
[0004]体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义。如用小鼠、大鼠或家兔等作实验材料，体外受精技术可用于研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。在人类，IVF
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ET技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。
[0005]随着现代农业科技的发展，为了更充分利用良种母牛的繁殖潜力，加速遗传育种进程，在生产实践中应用高效的繁殖新技术成为必然。活体采卵(Ovum pick UP，OPU)和体外受精技术(In Vitro Fertilization，IVF)是二十世纪八十年代快速发展起来的胚胎工程新技术，二者相结合可获得大量遗传系谱明确的胚胎，从而缩短世代间隔。目前，这两种技术已经成为欧美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群而采用的重要繁殖技术。
[0006]例如，在先申请案CN108728404A(申请号：201810576806.3)公开了一种牛体外受精胚胎培养的方法，其包括如该文献所述步骤。在先申请案CN111254109A(中国专利申请号2020100820171)为克服运输困难的问题，提供了一种运输培养液，其中包含甘氨酸等，使用该运输培养液进行牛卵母细胞的体外受精和胚胎培养的方法包括如下步骤：卵母细胞的采集和体外成熟、体外受精、胚胎体外培养及保存。该专利技术方法和运输培养液取得了优异的技术效果。此外，在先申请案CN112322579A(中国专利申请号2021100106576)涉及牛体外受精使用的培养液和提高牛体外受精的方法。牛体外受精的方法包括如该文献所述步骤。在体外受精操作完毕后，需要使受精卵进行体外发育即进行胚胎体外培养，得到的可用胚胎可以进行液氮冷冻保存。暂时性的冷冻保存对于提高动物繁殖效率是有益的。上述
CN108728404A、CN111254109A和CN112322579A通过引用以其全部内容并入本文。
[0007]在获得大量的体外受精胚胎后，一方面通常需要将该胚胎进行冻存进而等待有适宜生理期的受体母牛以进行胚胎体内繁殖，另一方面还有需要对这些胚胎进行性别鉴定以便根据需要选择适宜性别的胚胎移植到母体牛体内进行繁殖。
[0008]上述通过胚胎性别鉴定以供胚胎移植时的性别选择，即为通常意义上的性别控制技术。
[0009]众所周知，性别控制技术在畜牧生产中意义重大，这在刘阳文献[刘阳，等，动物胚胎性别鉴定技术的研究进展，畜禽业，2007，(03)：4～5]中有详细记述。首先，家畜的性别控制技术是一项能显著提高家畜繁殖率的生物工程技术，控制后代的性别比例可增加选种强度，加快育种进程，对家畜育种、生产和遗传疾病的防治均有非常重要的意义。其次，家畜的性别控制技术也是畜牧业生产中的一项具有重要意义的繁殖技术，因为畜牧生产中许多重要的经济性状都与性别有关，例如：肉、蛋、奶、毛、茸等，通过控制后代的性别比例，可允许发挥受性别限制的生产性状(如泌乳)和受性别影响的生产性状(如生产速度、肉质等)的最大经济效益。随着分子生物学、细胞遗传学、免疫组织学等学科的迅速发展，以及现代高精密度仪器的问世，性别控制研究取得了长足的发展。目前，性别控制技术主要是在受精前性别控制和受精后性别控制这2个阶段进行。受精前性别控制最理想的途径是采取X和Y精子分离，然后有目的地进行受精。受精后性别控制则是通过附植前胚胎的性别鉴定达到性别控制目的。但是从现在X、Y精子分离技术的发展来看。虽然使用流式细胞分类仪已成功分离了X、Y精子。但其成本高，分离效率较低，一时还难以在实际应用中推广。而胚胎性别鉴定方面，则取得了巨大的发展，已进入实用阶段。
[0010]性别控制技术的发展源于性别决定的基因调控理论，性别控制分为性别决定和性别分化两个过程。动物性别决定是指动物早期胚胎未分化性腺分化为睾丸或卵巢的过程。决定性别的关键在于Y染色体，Y染色体的有无分别决定雄性和雌性。决定雄性的是Y染色体短臂和1个微小片段，称为Y染色体上的性别决定区，是启动睾丸形成的主基因。近年来，先后发现SRY、DMRT1、SOX9、SF
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1、WT1、LIM1、LHX9和DAX
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1等基因对动物性别的决定和性器官的分化起着重要作用[张秀华，等，性别决定机理与性别鉴定的研究进展，中国畜牧兽医，2004，7(31)：23～25]。这一过程中，在雄性胚胎中主要涉及到SRY的表达，SRY的表达启动睾丸的形成，进而间接引发雄性动物第二性征的形成。性别分化主要是指定型的性腺调节生殖结构的形成。这个过程主要受性腺激素调控。对于雄性动物，性腺激素主要包括MIS及睾酮。
[0011]随着分子遗传学、发育生物学及相关学科的发展，人们对性别分化的认识提高到分子水平，家畜胚胎性别鉴定方法也随之发展到分子水平。目前已发展了许多胚胎性别鉴定的方法，主要有细胞遗传学方法、H
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Y抗原法、雄性特异性DNA探针法、PCR法、环介导等温扩增法等。
[0012]PCR性别鉴定技术是目前已知相当成熟的技术。Herr等于1990年首先成功建立了牛、羊胚胎性别鉴定的PCR法。PCR法具有特异性强、灵敏度高、快速准确、对胚胎影响小等优点，因此其在家畜胚胎性别鉴定中占有越来越重要的位置。其实质就是Y
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染色体特异性片段或Y
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染色体上的性别决定基因的检测技术。PCR能扩增出目标条带的胚胎即为雄性胚胎，否则即本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于牛早期胚胎性别鉴定例如权2
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10所述方法的PBS液，其pH值为6.8~7.2且是照如下方式配制的：取磷酸氢二钾9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟；例如，该PBS液的pH值为6.8~7.2且是照如下方式配制的：取磷酸氢二钾9.39g、磷酸二氢钾3.5g、果糖20~30g(例如25g)和壬酸钠1.0~1.5g (例如1.25g)，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。2.牛早期胚胎性别鉴定的方法，其包括如下步骤：(1)使卵母细胞和精子进行体外受精，受精卵培养得到桑椹胚；(2)将分选的生长良好的桑椹胚用分割液洗涤，接着移入PBS液中预处理20min，然后移入分割液滴内，置于倒置显微镜下，用分割刀割取(例如至少2份，例如2份)包含10~12个细胞的胚胎组织作为性别鉴定的样品；(3)提供环介导等温扩增实时浊度检测系统和环介导等温扩增法性别鉴定试剂盒，该试剂盒由雄性反应用Master Mix I、雌雄共同反应用Master Mix II、BstDNA polyrrlerase、Extraction Solution(DNA提取液)、Control DNA(阳性对照)组成；(4)样品制作胚胎样品：将切割的包含分割液6μl的胚胎样品放入灭菌离心管中，加入DNA提取液即Extraction Solution液12μl，使其悬浊，在室温下放置5min以上，混匀后离心，制成样品溶液，备用；阴性对照样品：取分割液6μl放入灭菌离心管中，加入DNA提取液即Extraction Solution液12μl，使其悬浊，在室温下放置5min以上，混匀后离心，制成阴性对照样品溶液，备用；阳性对照样品：取6μl的Control DNA放入灭菌离心管中，加入DNA提取液即Extraction Solution液12μl，使其悬浊，在室温下放置5min以上，混匀后离心，制成阳性对照样品溶液，备用；(5)配制Master Mix在冰浴条件下配制，雄性反应用Master mix(即反应混合液I)：取60μl的Master Mix I置灭菌离心管中，加3μl的BstDNA polyrrlerase，混匀，离心，即得；雌雄共通反应用Master mix(即反应混合液II)：取60μl的Master Mix II置灭菌离心管中，加3μl的BstDNA polyrrlerase，混匀，离心，即得；(6)样品混合每份检品用2支反应离心管；取6个反应离心管，1、2、3号管中分别加入20μl反应混合液I，4、5、6号管中分别加入20μl反应混合液II；取阴性样品、胚胎样品、阳性对照(Control DNA)各5μl分别加入到1、2、3号反应管中，另取阴性样品、胚胎样品、阳性对照(Control DNA)各5μl分别加入到4、5、6号反应管中，充分混合、离心；(7)环介导等温扩增扩增反应、检测和结果判定将6个反应离心管置环介导等温扩增实时浊度检测系统中于63
°
C扩增40min，反应结束后记录各管中以“+”和
“‑”
表示的结果，按下表进行雌雄判定：
在阴性对照和阳性对照的结果均为正确的前提下，依据样品在两种反应混合液中的结果，判定该样品为雄性、雌性、不确定需要重做三类情形。3.根据权利要求2的方法，其中：所述的牛选自：中国黄牛、荷斯坦牛、西门塔尔牛、中国水牛、日本和牛。4.根据权利要求2的方法，步骤(1)是照如下方式进行的：(11)采集卵母细胞并使其进行体外成熟；(12)使精子悬液与成熟的卵母细胞在受精培养液滴孵育以完成体外受精；(13)体外受精操作完毕后使胚胎在胚胎培养液中培养至桑椹胚生长良好，显微镜下挑选出桑椹胚。5.根据权利要求4的方法，其中：步骤(11)中，采集卵母细胞是照下述方式进行的：离体采集：取屠宰场卵巢盛放于加双抗生理盐水的保温桶中，31~33℃条件下，3h内运回实验室；抽取表面2~8mm的卵泡，收集沉淀，在体视显微镜下捡出至少含有3层卵丘细胞包裹的卵母细胞COCs(即，卵丘
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卵母细胞复合体)，在洗卵液中洗涤2遍，去除多余杂质；或者活体采集：对牛进行活体采卵，将所得卵泡液在体视显微镜下捡出至少含3层卵丘细胞包裹的卵丘
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卵母细胞复合体(COCs)，放入包含HEPES的成熟培养液中38.8℃、3h内运回实验室；步骤(11)中，卵母细胞体外成熟是照下述方式进行的：采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22~24h，培养条件为38.8℃、5.5~6.5% CO2、饱和湿度，使卵母细胞体外成熟；步骤(12)体外受精是照下述方式进行的：将成熟的COCs在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；从液氮中取一支冻...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小武，王娜，陈建美，郝少强，赵明礼，郭春明，李琳，许晓椿，
申请(专利权)人：天津博裕力牧科技有限公司，
类型：发明
国别省市：