用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法技术

本发明专利技术涉及用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法。上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基，包括：5g/L

【技术实现步骤摘要】
用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法。

技术介绍

[0002]碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)可去除DNA、RNA的5
’
端磷酸基团，在分子克隆中，常用于阻止载体的自连作用，提高目的片段插入率。碱性磷酸酶还可制备用于5
’
端标记的DNA模板。此外，碱性磷酸酶可催化磷酸盐化合物水解，被广泛应用于免疫标记和化学发光；在临床定位诊断，病因分析以及肿瘤诊断和治疗方面具有十分重要的应用。
[0003]目前，研究的最多的是大肠杆菌碱性磷酸酶，商品化的碱性磷酸酶包括大肠杆菌磷酸酶、牛小肠碱性磷酸酶、虾碱性磷酸酶。但仍普遍存在不易大规模生产，酶产量低；在发酵工业中，工程菌往往由于表达载体、表达宿主、表达条件等，使菌体高密度生长和重组蛋白的高水平表达受限，从而致使工程菌无法真正适用于工业化生产中。如何提高碱性磷酸酶的单位酶活和表达量是一个亟需解决的问题，对碱性磷酸酶的生产和应用具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0004]基于此，有必要提供一种能够提高碱性磷酸酶单位酶活和表达量的培养基和碱性磷酸酶的制备方法。
[0005]一种用于发酵产碱性磷酸酶的培养基，包括：包括：5g/L
‑
15g/L的葡萄糖、10g/L
‑
20g/L的蛋白胨、3g/L
‑
10g/L的酵母粉、2g/L<br/>‑
7g/L的NaCl、2.5g/L
‑
7.5g/L的(NH4)2SO4、3g/L
‑
4g/L的KH2PO4、5g/L
‑
6g/L的K2HPO4、0.3mg/L
‑
4.5mg/L的MnCl2·
4H2O、0.1mg/L
‑
0.5mg/L的Na2MoO4·
2H2O、1mg/L
‑
5mg/L的FeCl3·
6H2O、3mM
‑
10mM的Mg
2+
、0.05mM
‑
0.5mM的Zn
2+
。
[0006]上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基中，各组分配比合理，用于发酵产碱性磷酸酶的单位酶活和表达量均较高。经试验验证，采用上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基对重组大肠杆菌进行发酵培养，重组大肠杆菌的生物量达到25.7gDCW/g，发酵液所含碱性磷酸酶达到8901U/mL。
[0007]其中一个实施例中，包括：10g/L的葡萄糖、15g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、5g/L的NaCl、5g/L的(NH4)2SO4、3.25g/L的KH2PO4、5.75g/L的K2HPO4、4mg/L的MnCl2·
4H2O、0.5mg/L的Na2MoO4·
2H2O、5mg/L的FeCl3·
6H2O、5mM的MgSO4·
7H2O、0.1mM的ZnCl2。
[0008]其中一个实施例中，所述Mg
2+
选自MgSO4及MgCl2中的至少一种，所述Zn
2+
选自ZnSO4及ZnCl2中的至少一种。
[0009]其中一个实施例中，还包括溶剂，所述溶剂选自去离子水及蒸馏水中的至少一种。
[0010]其中一个实施例中，还含有余量的所述溶剂。
[0011]一种碱性磷酸酶的制备方法，包括如下步骤：
[0012]采用上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基发酵培养重组大肠杆菌，得到碱性磷酸
酶，其中，所述重组大肠杆菌携带有碱性磷酸酶基因片段。
[0013]其中一个实施例中，所述采用上述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基发酵培养重组大肠杆菌的步骤包括：
[0014]将对数期的所述重组大肠杆菌的种子液以1％
‑
8％的接种量接入装有所述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基的发酵罐中进行发酵，当葡萄糖耗尽、溶氧开始回升时进行补料发酵，补料过程中维持溶氧为30％
±
10％，其中，发酵pH为7.0
±
0.05；
[0015]当所述发酵液的OD
600
至30以上时，向所述发酵液中加入诱导剂后继续发酵，直至OD
600
维持恒定或开始下降时停止发酵，得到所述碱性磷酸酶。
[0016]其中一个实施例中，补料发酵过程中所用的补料培养基包括：500g/L的葡萄糖、80mM的MgSO4、1.5mM的ZnCl2及溶剂，其中，所述Mg
2+
选自MgSO4及MgCl2中的至少一种，所述Zn
2+
选自ZnSO4及ZnCl2中的至少一种，所述溶剂选自去离子水及蒸馏水中的至少一种。
[0017]其中一个实施例中，将对数期的所述重组大肠杆菌的种子液以1％
‑
8％的接种量接入装有所述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基的发酵罐中进行发酵的步骤之前，还包括如下步骤：
[0018]将所述重组大肠杆菌保藏菌种以体积浓度为0.1％
‑
1％接种至种子培养基中在37℃、200rpm下培养10小时
‑
20小时，得到一级种子液，其中，所述种子培养基含有LB培养基；
[0019]将所述一级种子液以体积浓度为0.05％
‑
0.5％接种至所述种子培养基中在37℃、200rpm下培养5小时
‑
15小时，得到对数期的所述重组大肠杆菌的种子液。
[0020]其中一个实施例中，发酵条件包括：200rpm
‑
750rpm的转速、0.5vvm
‑
2vvm的通气量、37℃的发酵温度、0.03MPa
‑
0.07MPa的罐压。
[0021]其中一个实施例中，在发酵过程中，开始发酵的转速为200rpm；每当溶氧低于30％时将转速提高50rpm；当转速达到750rpm时维持恒定，继续发酵至溶氧开始回升时进行所述补料发酵。
[0022]其中一个实施例中，所述诱导剂为终浓度0.1mM
‑
1.5mM的异丙基硫代半乳糖苷。
[0023]其中一个实施例中，向所述发酵液中加入所述诱导剂后继续发酵的温度为20℃
‑
37℃。
[0024]上述碱性磷酸酶的制备方法，采用特定发酵培养基及补料培养基配方，通过采用DO
‑
STAT偶联控制流加补料，通过添加诱导剂高效诱导，有效控制了菌体的生长速率，预防了菌体生长过快引起的产酸积累，反馈抑制，培养基浪费等弊端，极大的提高了菌体浓度，达到高密度发酵的目的。优化的诱导剂和诱导条件，极大的提高了单位发酵液碱性磷酸酶的活力。利用上述制备方法，重组大肠杆菌的生物量达到25.7gDCW/g，发酵液所含碱性磷酸酶达到8901U/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于发酵产碱性磷酸酶的培养基，其特征在于，包括：5g/L
‑
15g/L的葡萄糖、10g/L
‑
20g/L的蛋白胨、3g/L
‑
10g/L的酵母粉、2g/L
‑
7g/L的NaCl、2.5g/L
‑
7.5g/L的(NH4)2SO4、3g/L
‑
4g/L的KH2PO4、5g/L
‑
6g/L的K2HPO4、0.3mg/L
‑
4.5mg/L的MnCl2·
4H2O、0.1mg/L
‑
0.5mg/L的Na2MoO4·
2H2O、1mg/L
‑
5mg/L的FeCl3·
6H2O、3mM
‑
10mM的Mg
2+
、0.05mM
‑
0.5mM的Zn
2+
。2.根据权利要求1所述的用于发酵产碱性磷酸酶的培养基，其特征在于，包括：10g/L的葡萄糖、15g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、5g/L的NaCl、5g/L的(NH4)2SO4、3.25g/L的KH2PO4、5.75g/L的K2HPO4、4mg/L的MnCl2·
4H2O、0.5mg/L的Na2MoO4·
2H2O、5mg/L的FeCl3·
6H2O、5mM的Mg
2+
、0.1mM的Zn
2+
。3.根据权利要求1
‑
2任一项所述的用于发酵产碱性磷酸酶的培养基，其特征在于，还含有余量的溶剂，所述溶剂选自去离子水及蒸馏水中的至少一种；及/或，所述Mg
2+
选自MgSO4及MgCl2中的至少一种，所述Zn
2+
选自ZnSO4及ZnCl2中的至少一种。4.一种碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：采用权利要求1
‑
3任一项所述的用于发酵产碱性磷酸酶的培养基发酵培养重组大肠杆菌，得到碱性磷酸酶，其中，所述重组大肠杆菌携带有碱性磷酸酶基因片段。5.根据权利要求4所述的碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，所述采用权利要求1
‑
3任一项所述的用于发酵产碱性磷酸酶的培养基发酵培养重组大肠杆菌的步骤包括：将对数期的所述重组大肠杆菌的种子液以1％
‑
8％的接种量接入装有所述用于发酵产碱性磷酸酶的培养基的发酵罐中进行发酵，当葡萄糖耗尽...

【专利技术属性】
技术研发人员：王梁，姜涛，徐灿，宫安，罗漫杰，
申请(专利权)人：武汉瀚海新酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：