一种日本对虾耐低温的分子标记A257及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种日本对虾耐低温的分子标记A257及其应用。所述分子标记A257的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，为Indel标记，该低温耐受型基因型为AA纯合插入基因型。所述分子标记A257的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。本发明专利技术提供的分子标记A257可以不受日本对虾生长阶段的限制，明显加快日本对虾的选育进程并快速选育出具备耐受低温优良性状的日本对虾新品种，并且使用该分子标记A257及其以扩增引物检测日本对虾耐低温性状准确可靠且操作简单，有利于日本对虾的健康养殖，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种日本对虾耐低温的分子标记A257及其应用


[0001]本专利技术属于水产动物分子标记辅助育种领域，具体涉及一种日本对虾耐低温的分子标记A257及其应用。

技术介绍

[0002]日本对虾（Marsupenaeus japonicus）原称日本对虾，隶属十足目、对虾科、囊对虾属，分布在印度
‑
西太平洋热带、非洲东海岸、马来西亚、日本、朝鲜、中国东南沿海等海域，是中国主要对虾养殖品种之一，日本对虾生长迅速、耐干露、色泽艳丽和经济价值高，深受水产品市场和养殖者欢迎，从我国南方到北方沿海各省市均有养殖，并形成一定的规模。良种繁育对日本对虾养殖业具有重要意义。耐低温是日本对虾的重要抗逆性状。一方面，由于日本对虾具有较高的市场需求，该种对虾主要在中国北方水域进行养殖，其中包括山东、河北、江苏等北方省份的海水水域，耐低温成为中国北方日本对虾养殖业追求的重要抗逆性状；另一方面，在中国的春节时期，鲜活日本对虾的市场价格是平常季节的3倍以上，北方等地的对虾养殖农户经常冒险的将上市时间拖到冬季，又往往因冬季寒潮造成水温骤降引起养殖对虾大规模死亡，耐低温品种的选育也是日本对虾养殖业的迫切需求。
[0003]分子标记是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。分子标记具有显著的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；生物发育不同阶段、不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记检测手段简单、迅速。目前，有关日本对虾耐低温的分子标记开发的研究较少，并且产业中缺乏可应用于分子标记辅助育种的标记。因此，开发耐低温性状相关分子标记对日本对虾的健康养殖及加速育种进程具有重要的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种日本对虾耐低温的分子标记A257及其应用。本专利技术的分子标记A257可以用于日本对虾低温耐受品种的筛选，且鉴定效率及准确率高，有助于日本对虾耐低温性状的培育及养殖业发展。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种日本对虾耐低温的分子标记A257，所述分子标记A257的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0006]进一步的，所述分子标记A257中第510位碱基为A。
[0007]进一步的，所述分子标记A257的低温耐受基因型为AA纯合插入基因型。
[0008]本专利技术还提供了所述的分子标记A257的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
[0009]本专利技术还提供了所述的分子标记A257或所述的扩增引物在筛选日本对虾耐低温品种中的应用。
[0010]进一步的，所述日本对虾耐低温品种的筛选步骤为：（1）合成核苷酸序列如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的扩增引物；（2）提取待测日本对虾的基因组DNA；（3）利用扩增引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行测序；（4）测序结果中若出现基因纯合插入突变，则该日本对虾为耐低温品种。
[0011]进一步的，所述步骤（4）中测序结果中出现AA基因纯合插入突变，即分子标记A257第510位碱基为A，则该日本对虾为耐低温品种。
[0012]进一步的，所述PCR扩增的条件为：预变性94℃，5min；变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，30s，重复32个循环；循环外延伸72℃，7min。
[0013]本专利技术还提供了所述的分子标记A257或所述的扩增引物在日本对虾遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建中的应用。
[0014]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：1、本专利技术提供的日本对虾耐低温的分子标记A257可以不受日本对虾生长阶段的限制，能够用于日本对虾早期虾苗及亲本的选育，进而明显加快日本对虾的选育进程以及快速选育出具备低温耐受优良性状的日本对虾新品种。2、利用本专利技术提供的分子标记A257及其扩增产物检测日本对虾耐低温的性状，方法准确可靠、操作简单，能够有效、快速的筛选出符合要求的性状，辅助早期实现短时间、低成本的选育出耐受低温的日本对虾的品种，增加优良品质的日本对虾数量，提高日本对虾的养成率及养殖周期，进而提高日本对虾产量，促进其健康繁殖，因此具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：本专利技术中低温耐受群体和低温不耐受群体两组对应位置测序结果差异峰图。
具体实施方式
[0015]以下结合具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。
[0016]本专利技术所用的日本对虾均来自青岛瑞兹海珍品有限公司实验基地。体重10
±
3g的日本对虾300只，放置于4个养殖池(500cm
×
300cm
×
150cm)中暂养7d，暂养期间水温保持在28
±
1℃，加水至20cm，pH8.2
±
0.5，持续供氧，每天早上8点更换新鲜海水，下午5点投喂新鲜蛤蜊肉，喂食量约为对虾体重的10%。7d后挑选活力好、体表完整的日本对虾进行后续实验。
[0017]以10
±
0.5℃作为应激条件，对300尾日本对虾进行低温耐受性实验，统计个体的耐受时间，将首先死亡的20尾虾作为低温敏感组（UT），将最后仍然存活的20尾虾作为低温耐受组（T）。利用天根海洋动物组织基因组提取试剂盒(TIANGEN，天根生化科技有限公司)分别提取低温不耐受组和低温耐受组的日本对虾的基因组DNA。
[0018]实施例1一、耐低温相关候选分子标记筛选1、测序数据过滤和比对提取日本对虾的基因组DNA，低温耐受组和不耐受组各20个个体。利用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取日本对虾基因组DNA。首先，将大约30mg的
组织样品放到1.5 mL 的无菌酶离心管，加入200 μL GA缓冲液和20 μL Proteinase K溶液，漩涡混匀，56℃孵育至组织完全裂解。然后加入200 μL GB缓冲液，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮，剪短离心出去内壁水珠。加入200 μL 无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心，然后将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD，12000 rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600 μL 漂洗液PW，12000 rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。弃废液(重复一次)，再加入700 μL漂洗液PW，12000 rpm离心30s，弃废液。12000 rpm空离2min，以彻底除去残留的试剂。将吸附柱CB3置于干净的离心管中，在柱的中心加入40 μL水，室温静置15min，12000 rpm离心2min，洗脱DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种日本对虾耐低温的分子标记A257，其特征在于，所述分子标记A257的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的日本对虾耐低温的分子标记A257，其特征在于，所述分子标记A257中第510位碱基为A。3.根据权利要求1所述的日本对虾耐低温的分子标记A257，其特征在于，所述分子标记A257的低温耐受基因型为AA纯合插入基因型。4. 权利要求1所述的分子标记A257的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。5.权利要求1所述的分子标记A257或权利要求4所述的扩增引物在筛选日本对虾耐低温品种中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述日本对虾耐低温品种的筛选步骤为：（1）合成核苷酸序列如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：任宪云，贾少婷，王琼，孟宪亮，邵慧鑫，徐垚，刘萍，李健，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：