筛选转基因植物的组合物和方法技术

本发明专利技术公开了筛选转基因植物的组合物和方法。本发明专利技术利用植物花青素生物合成途径中的酶类基因DFR、LDOX、UFGT构建了筛选植物转基因的载体以及含有该载体的宿主细胞，并将所述载体及宿主细胞用于筛选转基因植物，巧妙地利用花青素的显色，在愈伤组织阶段即可筛选出植物转基因的阳性细胞，有效地减轻转化后筛选的工作量。本方法能够在悬浮培养的愈伤组织中进行无细胞损伤的筛选，筛选过程无需进行组织化学检测或利用特殊的仪器设备，肉眼观测即可。利用本方法可获得高阳性率的转基因愈伤组织，极大缩短了筛选培养的时间。大缩短了筛选培养的时间。大缩短了筛选培养的时间。

【技术实现步骤摘要】
筛选转基因植物的组合物和方法


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种植物转基因阳性细胞的筛选方法。

技术介绍

[0002]现行的植物基因工程一般通过农杆菌介导侵染宿主植物的愈伤组织，通过农杆菌的T
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DNA介导将外源基因序列转化、并随机插入到植物细胞中基因组中。因常规转基因方法构建的转基因细胞效率较低，需要通过一定的筛选方法对阳性细胞进行筛选，目前常用筛选方法为抗生素筛选和除草剂筛选。但受限于植物细胞和转染方法的特殊性，该筛选方式将获得大量假阳性细胞，继而形成嵌合体细胞团。此外，潮霉素或除草剂对液体环境培养的植物愈伤组织筛选能力远低于固体培养的植物愈伤细胞，实践操作中难以进行。因此，迫切需要寻找一种能够在植物转基因系统中，使用便捷、可靠性更高、且同时适用于固体和液体培养的新筛选方法。
[0003]我们在初始研究中，目标是建立一种可视化、不损伤细胞即可进行持续检测鉴定的植物转基因筛选方法。最为直接的是以GFP、RFP等荧光蛋白和目的蛋白进行共表达，在相应激发光源下持续进行筛选，直至获得完全荧光的愈伤组织。但由于植物的细胞壁和胞外结构对常规荧光检测有强烈干扰，GFP等荧光蛋白的筛选不得不借助高精度仪器，操作要求较高，难以实现大量、简便的筛选。
[0004]花青素是一类在植物中广泛存在的次级代谢产物，属于黄酮类物质。花青素赋予植物缤纷的色彩，在植物发育过程中，具有使植物免受紫外辐射、抗病原菌侵染等重要生理作用。同时，花青素在治疗心脏病和癌症，清除自由基、抗氧化、抗衰老等方面具有重要疗效。因此，可以利用花青素的这些特点，将花青素合成途径的结构基因及其调控因子基因作为一类可视化、安全和有效的标记基因来转化植物。不仅可以有效地减轻转化后筛选的复杂工作，目的性强，也大为提高实验结果的准确度和可信度，为开展转化后的分析工作奠定了很好的基础。
[0005]现有技术中，已有利用花青素显色来筛选转基因植物的方法。中国专利CN102352375B将花青素合成途径中的两个基因转录因子bi和cl基因运用到植物转基因中，根据基因在植株上的颜色表现，有选择的保留有价值的转化材料。中国专利CN102719450B将花青素调节基因Rosea 1和Delila整合进菊花基因组，转基因植物茎部在自然条件下出现明显紫红色，与对照有明显差异，从而区别转基因与非转基因植株。然而，现有技术中的筛选方法大多需要经过植物组织培养过程，即被转化的植物细胞要通过组织培养的方法进行植株再生，经过多代筛选，才能得到转基因阳性的植株，而植物组织培养过程存在繁琐冗长，耗时长，假阳性多等问题。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的缺陷，本专利技术提供了能够筛选转基因植物的组合物和方法。
[0007]本专利技术利用植物花青素生物合成途径中的部分酶来构建高效的表达载体，将花青素合成所需的酶基因及外源基因转入水稻愈伤组织中，通过花青素在愈伤组织的表达来快速、高效地筛选转基因植物阳性细胞。
[0008]图1是植物中常见花色素苷生物合成途径(刘娟,冯群芳,张杰.二氢黄酮醇4
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还原酶基因(DFR)与花色的修饰[J].植物生理学报,2005,41(006):715
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719.)，该途径内的不同酶类具有一定的时空表达特异性。经过多次试验证明，向植物中转入合成途径中的酶类DFR、ANS、3GT可能是本专利技术中较好的植物转基因筛选的路线选择。其中虚线方框内的路径为葡萄中花青素的合成路径，葡萄中与上述酶类对应的基因为：DFR、LODX、UFGT。
[0009]植物中花色素种类繁多，提供了各种颜色的选择空间，图1中，经过DFR催化的三种不同的反应底物二氢杨梅黄酮(DHM)、二氢槲皮素(DHQ)或二氢堪非醇(DHK)使愈伤组织最终呈现不同的颜色。基于显色的明显程度考虑，本领域技术人员可根据野生型植物愈伤组织的本底颜色，选择相应的DFR酶底物，以使得经转基因处理后的植物愈伤组织颜色与未经处理的植物愈伤组织颜色，通过肉眼即可清晰分辨，以确定转基因成功与否。
[0010]在一方面，本专利技术提供一种筛选转基因植物的载体，所述载体包含DFR、LDOX、UFGT基因，所述DFR的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述LDOX的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述UFGT的的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]根据密码子的简并性，针对某一基因，本领域技术人员可以设计出多种可编码该基因的序列。本领域技术人员可根据转基因植物的密码子偏好性对某一基因序列进行优化。在某些实施方式中，为实现DFR、LDOX、UFGT基因在植物花青素合成途径中的作用，其编码序列分别与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所记载的序列至少具有大约60％的相似性、大约65％的相似性、大约70％的相似性、大约75％的相似性、大约80％的相似性、大约85％的相似性、大约90％的相似性或大约95％的相似性、大约96％的相似性、大约97％的相似性、大约98％的相似性、大约99％的相似性。
[0012]在某些实施方式中，所述载体还包括其他标记基因，所述标记基因选自以下基因中的1种、2种，或3种：潮霉素除草剂抗性基因、卡那霉素抗生素抗性基因，氨苄青霉素抗生素抗性基因。
[0013]在某些实施方式中，所述载体筛选的转基因植物为双子叶植物或单子叶植物。优选的植物物种包括：烟草、水稻等，特别优选的植物物种为水稻。在某些实施方式中，所述植物为水稻。
[0014]在另一方面，本专利技术提供一种含有所述筛选转基因植物的载体的宿主细胞，宿主细胞可选自大肠杆菌、农杆菌、植物细胞等可供所述载体复制或表达的细胞。
[0015]在某些实施方式中，所述的DFR、LDOX、UFGT基因可以分别位于2个或3个载体中，也可以位于同一个载体中，包含DFR、LDOX、UFGT基因的载体共存于所述宿主细胞中。在某些实施方式中，DFR、LDOX、UFGT基因分别位于2个不同载体中。
[0016]在某些实施方式中，所述宿主细胞用于筛选的转基因植物为双子叶植物或单子叶植物。在某些实施方式中，所述植物为水稻。
[0017]在另一方面，本专利技术提供一种筛选转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：1)构建含有如权利要求1所述的DFR、LDOX、UFGT基因和外源基因的载体；2)将步骤1)构建的载体转入植物愈伤组织中，获得含有DFR、LDOX、UFGT和外源基
因的愈伤组织；3)添加DFR基因编码的酶的底物；4)挑选显色的愈伤组织；在某些实施方式中，还增加如下步骤，将挑选出的愈伤组织，于去除所述酶底物的培养基中培养1
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5天；挑选颜色褪去的愈伤组织颗粒。在某些实施方式中，进一步增加如下步骤，对颜色褪去的愈伤组织颗粒，重复上述步骤3)、4)，直到所有愈伤组织颗粒均全部完全显色。
[0018]在某些实施方式中，所述筛选转基因植物的方法中，所述载体还包括其他的标记基因，所述标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.筛选转基因植物的载体，所述载体包含DFR、LDOX、UFGT基因，所述DFR的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述LDOX的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述UFGT的的基因序列如SEQ ID NO.3所示。2.如权利要求1所述的载体，还包括其他标记基因。3.如权利要求2所述的载体，所述标记基因选自以下基因中的1种、2种，或3种：潮霉素除草剂抗性基因、卡那霉素抗生素抗性基因，氨苄青霉素抗生素抗性基因。4.如权利要求1
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3所述任一载体，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。5.如权利要求4所述的载体，所述植物为水稻。6.包含权利要求1
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3，5所述任一载体的宿主细胞。7.包含权利要求4所述任一载体的宿主细胞。8.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述的DFR、LDOX、UFGT基因可以分别位于2个或3个载体中，也可以位于同一个载体中。9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：所述的DFR、LDOX、UFGT基因可以分别位于2个或3个载体中，也可以在同一个载体中。10.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。11.如权利要求7
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9所述的任一宿主细胞，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。12.如权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于：所述植物为水稻。13.如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于：所述植物为水稻。14.筛选转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）构建含有如权利要求1所述的DFR、LDOX、UFGT基因和外源基因的载体；2）将步骤1）构建的载体转入植物愈伤组织中，获得含有DFR、LDOX、UFGT和外源基因的愈伤组织；3）添加DFR基因编码的酶的底物；4）挑选显色的愈伤组织。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于：还增加如下步骤，将挑选出的愈伤组织，于去除所述酶底物的培养基中培养1
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5天；挑选颜色褪去的愈伤组织颗粒。16.如权利要求15所述的方法，其特征在于：还增加如下步骤，对颜色褪去的愈伤组织颗粒，重复权利要求14的步骤3）、4），直到所有愈伤组...

【专利技术属性】
技术研发人员：王益行，吕晓荣，宋淼泉，凌建群，
申请(专利权)人：江苏吉锐生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：