特异性识别ACE2蛋白的ssDNA适配体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种特异性识别ACE2蛋白的ssDNA适配体，除SELEX技术外，结合高通量测序技术及生物信息学分析，降低筛选轮次并获得更丰富的候选适配体，后采用酶联核酸适配体方法分析其亲和性和特异性，得到特异性识别ACE2蛋白的ssDNA适配体。本发明专利技术的ssDNA适配体可竞争性结合ACE2蛋白，从而中和病毒，在抗病毒方面具有潜在的应用前景，也是新冠病毒特效药的有力备选。力备选。力备选。

【技术实现步骤摘要】
特异性识别ACE2蛋白的ssDNA适配体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种特异性识别ACE2蛋白的 ssDNA适配体及其应用。

技术介绍

[0002]2019年冠状病毒病全球性大流行，研发针对SARS
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CoV
‑
2的特异治疗药物是当务之急。SARS
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CoV
‑
2是一种单股正链RNA病毒，其外膜表面S 蛋白呈蘑菇状，使病毒形如皇冠状。SARS
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CoV
‑
2感染宿主细胞过程中，其 S蛋白受体结合结构域(RBD)识别并结合细胞表面血管紧张素转化酶2 (ACE2)的肽酶结构域，介导病毒入侵人体细胞。S蛋白RBD与ACE2蛋白的相互作用是病毒传播的重要决定因素之一。因此，设计靶向S蛋白或 ACE2蛋白的药物和抗体，或者设计另一种小分子来抑制S蛋白和ACE2蛋白的相互作用，有可能为新冠病毒药物的研制提供新线索。
[0003]目前，已有科研和医疗机构在研潜在的抗新型冠状病毒药物，包括一些中成药、活性天然产物和小分子抑制剂：(1)目前全球临床应用最多且获美国FDA批准的新冠治疗药物瑞德西韦(Remdesivir)是一种核苷类似物，具有抗病毒活性。但其是用于抗埃博拉病毒感染的药物，并非新冠特效药，虽然迄今不能认定瑞德西韦完全无用，但已有数据无法证明该药能显著提高患者的治疗效果，且瑞德西韦可能会产生严重副作用及其较高的成本和资源消耗，世界卫生组织并不推荐使用该药。(2)云南农大发现茶叶有效成分 EGCG能够强力结合新冠病毒S蛋白，并阻断其与ACE2受体结合；第二军医大学通过将人ACE2的胞外域连接到人免疫球蛋白IgG1的Fc区，生成了重组的ACE2
‑
Ig蛋白，可中和新冠病毒。但植物有效成分提取和重组蛋白制备，都存在操作繁琐、制备时间长及成本较高的问题。(3)哌加他尼(Macugen)是一种抗血管内皮生长因子的适配体，2004年12月经美国食品与药品监督管理局批准作为可用于治疗年龄相关的黄斑变性疾病的药物。已有核酸适配体在药物开发上的成功应用范例。但常规的核酸适配体筛选通常要进行十几轮，再进行克隆测序，不仅耗时耗力，且传统的测序通量很低，得到的适配体不一定是最佳的。
[0004]因此，目前仍旧没有临床疗效确切的抗病毒药物。核酸适配体能与靶标特异性结合，有望用于SARS
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CoV
‑
2的检测和治疗。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种特异性识别ACE2蛋白的 ssDNA适配体，具有特异性高、稳定性高、合成方便、易标记功能基团等特点，可特异性结合新冠病毒S蛋白的受体ACE2蛋白，阻断新冠病毒的结合感染，是新冠病毒特效药的有力备选。
[0006]本专利技术的一种特异性识别ACE2蛋白的ssDNA适配体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，具体序列为：
[0007]5’‑
TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTGTACCACCTTCCCCCGAACA ACGTTTTCCCCCCAACCCAACCCCTAGGAAGTACCGTACCATTGC
‑3’
。
[0008]进一步地，ssDNA适配体的3
’
端或5
’
端修饰有功能基团或分子。
[0009]进一步地，功能基团或分子为同位素、电化学标记物、酶标记物、荧光基团、生物素、亲和配基或巯基。功能基团或分子用于提高适配体的稳定性、提供检测信号，或者用于连接适配体与其他物质形成组合物。
[0010]本专利技术要求保护上述ssDNA适配体在制备抗病毒感染药物中的应用。
[0011]进一步地，上述药物用于预防或治疗病毒感染。
[0012]进一步地，上述药物为抗新冠病毒感染药物。
[0013]ACE2蛋白作为病毒受体，本专利技术提供的特异性识别ACE2蛋白的 ssDNA适配体可与病毒竞争性结合ACE2受体，从而阻断病毒的结合感染，如ssDNA适配体可与新冠病毒S蛋白竞争性结合ACE2蛋白，实现抗新冠病毒治疗。
[0014]本专利技术的一种抗新冠病毒感染的药物，包括上述ssDNA适配体。
[0015]进一步地，上述药物还包括抗新冠病毒的物质。
[0016]进一步地，抗新冠病毒的物质为抑制新冠病毒增殖的物质或促进细胞抗新冠病毒作用的物质。
[0017]进一步地，抗新冠病毒的物质为天然植物提取物、动物提取物、重组蛋白、抗体、化学合成高分子或化学合成小分子。
[0018]借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：
[0019]本专利技术为新冠病毒的治疗提供了可在体外筛选、可高通量获得、筛选周期短、合成方便且稳定性良好、亲和力高、易修饰和标记的高特异性适配体序列，同时，本专利技术的适配体可单独使用或携带相关药物，对新冠病毒疾病的治疗具有潜在开发前景。
[0020]上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
[0021]为了使本专利技术的内容更容易被清楚的理解，下面根据本专利技术的具体实施例并结合附图，对本专利技术作进一步详细的说明。
[0022]图1为人ACE2蛋白的纯化结果；
[0023]图2为第0、3、5、9、10、12轮筛选后核酸适配体的吸光图；
[0024]图3为ACE2 Aptamer A1的二级结构图谱；
[0025]图4为ACE2 Aptamer A2的二级结构图谱；
[0026]图5为Aptamer n.c.的二级结构图谱；
[0027]图6为N Aptamer 2的二级结构图谱；
[0028]图7为酶联核酸适配体方法测定核酸适配体与蛋白之间相互作用的示意图；
[0029]图8为ACE2 Aptamer A1/A2与ACE2蛋白相互作用的特异性结果；
[0030]图9为ACE2 Aptamer A2与ACE2蛋白相互作用的亲和力结果。
具体实施方式
[0031]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0032]实施例
[0033]1、人ACE2蛋白的表达和纯化
[0034](1)将构建好的带谷胱甘肽S转移酶(GST)标签的重组PET28a目的基因表达质粒转化至大肠杆菌BL21菌株中，用IPTG诱导表达GST
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ACE2 重组蛋白。
[0035](2)采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶偶联物(Glutathione Sepharose)进行GST 标签蛋白纯化，通过SDS
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PAGE和BCA测量纯化的蛋白质。结果如图1所示，纯化后的ACE2蛋白约为120kD。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性识别ACE2蛋白的ssDNA适配体，其特征在于，所述ssDNA适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列。2.根据权利要求1所述的ssDNA适配体，其特征在于：所述ssDNA适配体的3
’
端或5
’
端修饰有功能基团或分子。3.根据权利要求2所述的ssDNA适配体，其特征在于：所述功能基团或分子为同位素、电化学标记物、酶标记物、荧光基团、生物素、亲和配基或巯基。4.权利要求1
‑
3任一项所述的ssDNA适配体在制备抗病毒感染药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴建锋，潘文，蒋涛，陈志强，吴奇涵，倪晓华，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：