一种豌豆根瘤菌RL3841菌株突变株的构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其是一种豌豆根瘤菌RL3841菌株突变株的构建方法及应用，该突变株通过将质粒pJQemrRΩSpe导入豌豆根瘤菌RL3841菌株中得到。本技术方案提供了一株具有较强环境适应能力和结瘤效率的突变菌株豌豆根瘤菌RLemrR。该菌株具有很强的根际和植株根部共生生存能力，能接种豌豆植株形成更多具有固氮能力的根瘤。而且其产生的菌株适用范围广，具有抗氧化物和药物，耐高温、耐酸和高盐的特性，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种豌豆根瘤菌RL3841菌株突变株的构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其是一种豌豆根瘤菌RL3841菌株突变株的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]在自然界氮素循环系统中，根瘤菌
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豆科植物共生固氮体系是化合态氮的主要来源之一。在共生过程中，土壤中的根瘤菌首先通过豆科植物根毛侵入，形成侵染线，进入根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤。根瘤菌则进入根瘤细胞，并继续繁殖，分化为类菌体。在根瘤中，类菌体含有的固氮酶可以将大气中的氮气还原成氨为植物提供氮源，植物则通过光合作用为根瘤菌提供碳源和固氮所必需的厌氧环境。生物固氮占全球年固氮总量的85％，而豆科植物
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根瘤菌共生体系是生物固氮的主要方式。由于在氮素化肥生产中伴随着日益严重的能源耗费和环境污染问题，人们认识到，接种性能优良的根瘤菌来提高共生固氮效率，从而提高生物固氮在现代农业生产的比重，进而控制氮素化肥用量，对农业生态环境保护和可持续发展都有重要作用。
[0003]豌豆是我国重要的食用豆类作物之一，因其营养丰富、用途广、生长周期短、易成熟而备受青睐。豌豆根瘤菌可以侵染豌豆植株的根部形成共生固氮根瘤。由于共生固氮提供了豌豆所需氮肥，因此要获得豌豆的丰产和较高的经济效益，必须充分发挥豌豆根瘤菌的共生固氮作用。豌豆对环境的适应能力强，有较强的耐酸、耐盐等能力，但是与豌豆进行共生的根瘤菌对酸性、高盐等环境的耐受能力较差，而且与土著菌相比，接种豌豆根瘤菌的植株竞争能力较差。这就要求获得环境适应性强、抗逆性强，共生结瘤能力强的豌豆根瘤菌株用于接种，以提高豌豆
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豌豆根瘤菌固氮的有效性，从而达到减少施加氮肥，并使豌豆增产的目的。豌豆根瘤菌外排系统EmrAB是一类存在于细胞膜上的蛋白质。豌豆根瘤菌可以通过外排系统EmrAB泵的特殊转运蛋白将药物、氧化物等从其胞内泵出到外部环境，从而导致豌豆根瘤菌的多药耐药性(MDR)。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供了一种提高豌豆根瘤菌环境适应能力和结瘤效率的方法，以及一种豌豆根瘤菌RL3841菌株突变株和构建方法。
[0005]本专利技术的技术方案为一种豌豆根瘤菌RL3841菌株突变株，通过将质粒pJQemrRΩSpe导入豌豆根瘤菌RL3841菌株中得到。
[0006]豌豆根瘤菌RL3841菌株突变株的构建方法，包括以下步骤：
[0007]步骤1.根据种豌豆根瘤菌RL3841菌株的emrR基因序列设计引物，扩增得到目的片段；
[0008]步骤2.将质粒pMD
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19T与目的片段连接后转化导入感受态细胞DH5α，抗性筛选，挑取单菌落转化子酶切后，测序验证得到阳性克隆质粒pMDemrR；
[0009]步骤3.将质粒pPH45ΩSpe用Sma I单酶切后获得的ΩSpe片段与经过fsp I单酶切
后的pMDemrR进行连接，转化导入感受态细胞DH5α，抗性筛选，挑取单菌落转化子酶切，验证筛选得到阳性克隆质粒pMDemrRΩSpe；
[0010]步骤4.将pMDemrRΩSpe质粒用Xba I和Xho I进行双酶切后获得的emrRΩSpe片段与经过Xba I和Xho I双酶切后pJQ200SK质粒酶连并转化感受态细胞DH5α抗性筛选，挑取单菌落转化子酶切，测序验证获得阳性克隆质粒pJQemrRΩSpe；
[0011]步骤5.通过三亲本接合，将供体菌pJQemrRΩSpe导入豌豆根瘤菌RL3841菌株中，经过抗性初筛、蔗糖致死复筛及庆大霉素抗性排除假阳性，挑取单菌落重组子，进行菌落PCR验证，构建豌豆根瘤菌RL3841菌株突变株即豌豆根瘤菌RLemrR。
[0012]而且，步骤1中引物为：
[0013]5’
AAAAAGCTTCTATTACGGCCATGATTACT3
’
[0014]以及5
’
AAATCTAGATTGCATAGGAAAGGTTGAGC3
’
。
[0015]而且，步骤5中进行菌落PCR验证所用引物为：
[0016]ΩSpe特异引物5
’
CGGTTTACAAGCATAAAGC3
’
[0017]以及豌豆根瘤菌RL3841基因组引物5
’
CCTAGATGCCGGCAAGACGC3
’
。
[0018]以及上述构建方法在提高豌豆根瘤菌环境适应能力和/或结瘤效率中的应用。
[0019]而且，所述提高环境适应能力为对十二烷基硫酸钠、过氧化氢、过氧化氢异丙苯和结晶紫的抗性。
[0020]而且，所述提高结瘤效率为提高共生结瘤和竞争结瘤能力。
[0021]与现有技术相比，该技术方案的有益效果在于：提供了一种构建豌豆根瘤菌EmrAB外排系统突变菌株的方法，并提供了一株具有较强环境适应能力和结瘤效率的豌豆根瘤菌Rhizobium leguminosarum RLemrR突变菌株。该菌株具有很强的根际和植株根部共生生存能力，能接种豌豆植株形成更多具有固氮能力的根瘤。而且其产生的菌株适用范围广，具有抗氧化物和药物，耐高温、耐酸和高盐的特性，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0022]图1为豌豆根瘤菌EmrAB外排系统操纵子。RL90058，pRL90058基因；RL90059，pRL90059基因；RL90060，pRL90060基因；
[0023]图2为emrR基因突变体RLemrR的构建过程。其中a)emrR基因的PCR扩增片段；b)含有pMDemrR质粒的酶切检测，1为pMD
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19T空载体，4位重组质粒pMDemrR；c)重组质粒pMDemrRΩSpe的酶切检测，1为pMDemrRΩSpe。d)重组质粒pJQemrRΩSpe的酶切检测，1为pJQemrRΩSpe。e)突变株RLemrR的菌落PCR检测，1为RL3841对照，2为RLemrR。M1为1kb DNA Ladder Marker，M2为DL2000 marker；
[0024]图3为100mmol/L的CuOOH对野生型RL3841和突变株RLemrR的抑菌效果。a)RL3841；b)RLemrR；
[0025]图4为pH 5.5条件下野生型RL3841和突变株RLemrR的生长情况。
具体实施方式
[0026]下面结合附图和实施例对本专利技术进行详细具体说明，本专利技术的内容不局限于以下实施例。
[0027]实施例1豌豆根瘤菌RL3841菌株EmrAB外排系统
[0028]在NCBI上通过生物信息学分析发现豌豆根瘤菌RL3841中有三个与多药耐药(MDR)外排泵相关的操纵子：emrA(pRL90059)，emrB(pRL90060)和emrR(pRL90058)，它们的基因结构如图1。emrA基因编码蛋白属于HlyD家族分泌蛋白，类似于多药耐药外排泵MFS转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种豌豆根瘤菌RL3841菌株突变株，其特征在于：通过将质粒pJQemrRΩSpe导入豌豆根瘤菌RL3841菌株中得到。2.根据权利要求1所述豌豆根瘤菌RL3841菌株突变株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1.根据种豌豆根瘤菌RL3841菌株的emrR基因序列设计引物，扩增得到目的片段；步骤2.将质粒pMD
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19T与目的片段连接后转化导入感受态细胞DH5α，抗性筛选，挑取单菌落转化子酶切后，测序验证得到阳性克隆质粒pMDemrR；步骤3.将质粒pPH45ΩSpe用Sma I单酶切后获得的ΩSpe片段与经过fsp I单酶切后的pMDemrR进行连接，转化导入感受态细胞DH5α，抗性筛选，挑取单菌落转化子酶切，验证筛选得到阳性克隆质粒pMDemrRΩSpe；步骤4.将pMDemrRΩSpe质粒用Xba I和Xho I进行双酶切后获得的emrRΩSpe片段与经过Xba I和Xho I双酶切后pJQ200SK质粒酶连并转化感受态细胞DH5α抗性筛选，挑取单菌落转化子酶切，测序验证获得阳性克隆质粒pJQemrRΩSpe；步骤5.通过三亲本接合，将供体菌pJQemrRΩSpe导入豌豆根瘤菌RL3841菌株中，经过抗性初筛、蔗糖致死复筛及庆大霉素抗性排除假阳性，挑取单菌落重组子，进行菌落PCR验...

【专利技术属性】
技术研发人员：程国军，罗莎，邹倩，胡爱奇，陈晓红，龙松华，李晓华，何冬兰，阎春兰，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：