一种西番莲无菌外植体的培育方法技术

本发明专利技术提供了一种西番莲无菌外植体的培育方法，涉及植物组培技术领域，包括以下步骤：采集西番莲幼嫩茎段作为外植体，冲洗后采用饱和洗衣粉液浸泡，漂洗，得预处理外植体；采用利福平溶液对预处理外植体进行无菌预培养，得到预培养外植体；将所述预培养外植体剪切成茎段后进行消毒处理，得到无菌茎段；将所述无菌茎段在MS基本培养基中进行培养，获得无菌西番莲外植体。本发明专利技术所述的培育方法通过外植体的两次预处理方法，升汞杀菌方法及时间等结合，在降低污染率的同时也降低了因消毒灭菌导致的褐化率和死亡率，从而大大提高了外植体的存活率，降低了组培的生产成本。降低了组培的生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种西番莲无菌外植体的培育方法


[0001]本专利技术涉及植物组培
，尤其涉及一种西番莲无菌外植体的培育方法。

技术介绍

[0002]西番莲(Passifloracaerulea L.)是典型的热带、亚热带浆果类果树，属于西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(Passiflora L.)，是一种多年生常绿藤本植物。西番莲果实具有独特而浓郁的芳香气味，酸甜可口，是著名的果汁用热带水果，有“果汁之王”的美誉。西番莲的组培技术到目前为止还难以推广应用于种苗繁育，其中主要原因之一就是外植体消毒难，尤其是从野外田间采集的外植体，由于表面和内部都携带一定数量的细菌和真菌，尤其是内生菌。目前开展的西番莲组织培养技术的研究以西番莲茎段为外植体，消毒均采用2％次氯酸钠、0.1％～0.2％升汞两种消毒剂，消毒时间为10～20min。结果是升汞的消毒效果明显优于次氯酸钠。所以，现有西番莲外植体消毒灭菌技术中通常选用0.1％～0.2％的升汞进行10～20min的消毒灭菌。但是，其仍存在下述缺点：1.随着消毒剂浓度或消毒时间的增加，污染率呈下降趋势，而死亡率和褐化率呈上升趋势，存活率呈下降趋势。2.内生菌很难根除，随着继代次数的增加，内生菌污染也随之严重。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种西番莲无菌外植体的培育方法，在降低污染率的同时也降低了因消毒灭菌导致的褐化率和死亡率，大大提高了外植体的存活率，降低了组培的生产成本。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种西番莲无菌外植体的培育方法，包括以下步骤：
[0006]采集西番莲幼嫩茎段作为外植体，冲洗后采用饱和洗衣粉液浸泡，漂洗，得预处理外植体；
[0007]采用利福平溶液对预处理外植体进行无菌预培养，得到预培养外植体；
[0008]将所述预培养外植体剪切成茎段后进行消毒处理，得到无菌茎段；
[0009]将所述无菌茎段在MS基本培养基中进行培养，获得无菌西番莲外植体。
[0010]优选的，所述外植体的长度为12～15cm，保留有3～4个腋芽、顶芽及顶芽上端的1～2片叶。
[0011]优选的，所述外植体浸泡的时间为10～30min。
[0012]优选的，所述漂洗的次数为2～4次。
[0013]优选的，所述利福平溶液的浓度为80～120mg/L，外植体浸入利福平溶液中2～3cm。
[0014]优选的，所述预培养温度为22～30℃，光照时间为8～12h/d，时间为2～4d。
[0015]优选的，所述无菌茎段长为0.8～2.0cm，带有1～2个腋芽。
[0016]优选的，无菌茎段消毒处理的具体方式为：采用体积分数为75～90％的酒精消毒
处理10～60s，再采用质量浓度为0.05～0.15％的升汞表面消毒10～12min，冲洗3～5次。
[0017]优选的，在MS基本培养基中培养8～12d，培养温度为25～28℃，光照强度为1000～2000lux，光照时间为8～12h/d。
[0018]优选的，所述每接种一个茎段需要25～30ml MS基本培养基。
[0019]本专利技术提供了一种西番莲无菌外植体的培育方法，大幅度提高了消毒灭菌的效果，表面真、细菌的污染降低到8％以下，内生菌的污染降低到30％左右，同时随着继代增殖的次数增加也不会加剧内生菌的严重。并通过外植体的两次预处理方法，升汞杀菌方法及时间等结合，在降低污染率的同时也降低了因消毒灭菌导致的褐化率和死亡率，从而大大提高了外植体的存活率，降低了组培的生产成本。
具体实施方式
[0020]本专利技术提供了一种西番莲无菌外植体的培育方法，包括以下步骤：
[0021]采集西番莲幼嫩茎段作为外植体，冲洗后采用饱和洗衣粉液浸泡，漂洗，得预处理外植体；
[0022]采用利福平溶液对预处理外植体进行无菌预培养，得到预培养外植体；
[0023]将所述预培养外植体剪切成茎段后进行消毒处理，得到无菌茎段；
[0024]将所述无菌茎段在MS基本培养基中进行培养，获得无菌西番莲外植体。
[0025]在本专利技术中，外植体的长度优选为12～15cm，进一步优选为13～14cm，更进一步优选为13.5cm；腋芽保留数量优选为3～4个，进一步优选为3个；顶芽及顶芽上端叶的数量优选为1～2片，进一步优选为1片。
[0026]在本专利技术中，外植体浸泡时间优选为10～30min，进一步优选为15～25min，更进一步优选为20min。
[0027]在本专利技术中，漂洗次数优选为2～4次，进一步优选为2～3次，更进一步优选为3次。
[0028]在本专利技术中，利福平溶液的浓度优选为80～120mg/L，进一步优选为90～110mg/L，更进一步优选为100mg/L；外植体浸入到利福平溶液中长度优选为2～3cm，进一步优选为2.5cm。
[0029]在本专利技术中，预培养温度优选为22～30℃，进一步优选为24～28℃，更进一步优选为25～27℃，再进一步优选为26℃；光照时间优选为8～12h/d，进一步优选为9～11h/d，更进一步优选为10h/d；预培养时间优选为2～4d，进一步优选为3～4d，更进一步优选为3d。
[0030]本专利技术中，所述无菌茎段长优选为0.8～2.0cm，进一步优选为1～1.8cm，更进一步优选为1.5cm；带有的腋芽数量优选为1～2个，进一步优选为1个。
[0031]本专利技术无菌茎段消毒处理步骤中，酒精的体积分数优选为75～90％，进一步优选75％；酒精消毒处理时间优选为10～60s，进一步优选为20～50s，更进一步优选为30s；升汞的质量浓度优选为0.05～0.15％，进一步优选为0.1％；表面消毒时间优选为10～12min，进一步优选为10～11min，更进一步优选为11min；冲洗次数优选为3～5次，进一步优选为4～5次，更进一步优选为4次。
[0032]本专利技术中，MS培养基中培养时间优选为8～12d，进一步优选为9～11d，更进一步优选为10d；培养温度优选为25～28℃，进一步优选为26～27℃，更进一步优选为26℃；光照强度优选为1000～2000lux，进一步优选为1250～1750lux，更进一步优选为1500lux。
[0033]本专利技术中，每接种一个茎段需要MS基本培养基优选为25～30ml，进一步优选为26～29ml，再进一步优选为27ml。
[0034]下面结合实施例对本专利技术提供的西番莲无菌外植体的培育方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0035]实施例1
[0036]在上午10点采取外植体，选取顶芽及3个腋芽，长约13.5cm，顶芽上端的1片叶的西番莲新抽的嫩茎段作为外植体，用饱和洗衣粉液浸泡外植体20min后，在自来水漂洗干净，再用无菌水漂洗3次。采用浓度为100mg/L的利福平溶液，外植体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种西番莲无菌外植体的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：采集西番莲幼嫩茎段作为外植体，冲洗后采用饱和洗衣粉液浸泡，漂洗，得预处理外植体；采用利福平溶液对预处理外植体进行无菌预培养，得到预培养外植体；将所述预培养外植体剪切成茎段后进行消毒处理，得到无菌茎段；将所述无菌茎段在MS基本培养基中进行培养，获得无菌西番莲外植体。2.如权利要求1所述的一种西番莲无菌外植体的培育方法，其特征在于，所述外植体的长度为12～15cm，保留有3～4个腋芽、顶芽及顶芽上端的1～2片叶。3.如权利要求1或2所述的一种西番莲无菌外植体的培育方法，其特征在于，所述外植体浸泡的时间为10～30min。4.如权利要求3所述的一种西番莲无菌外植体的培育方法，其特征在于，所述漂洗的次数为2～4次。5.如权利要求1或4所述的一种西番莲无菌外植体的培育方法，其特征在于，所述利福平溶液的浓度为80～120mg/L，外植体浸入利福平溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：管艳，李玲，刘世红，殷振华，桂明春，粱国平，唐敏，田海，
申请(专利权)人：云南省热带作物科学研究所，
类型：发明
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