谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307及其表面展示系统和构建方法技术方案

本发明专利技术公开了一种谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307及其表面展示系统和构建方法。该谷氨酸棒杆菌壁蛋白Ncgl1307的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307在谷氨酸棒杆菌中表达量高，可将其用于构建高展示效率的谷氨酸棒杆菌表面展示系统。本发明专利技术中的谷氨酸棒杆菌表面展示系统是以所述的谷氨酸棒杆菌壁蛋白Ncgl1307为锚定蛋白，将靶蛋白固定在谷氨酸棒杆菌细胞表面构成的，提高了谷氨酸棒杆菌表面展示系统的内源锚定蛋白的表达效率。效率。效率。

【技术实现步骤摘要】
谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307及其表面展示系统和构建方法


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307及其表面展示系统和构建方法。

技术介绍

[0002]微生物细胞表面展示技术是利用基因工程手段通过多肽片段(或蛋白质结构域)将目的片段以融合蛋白形式在微生物表面进行展示的新型基因工程技术，具体而言，是一种通过锚定蛋白将蛋白质或多肽固定在细胞表面的技术，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性。微生物细胞表面展示系统包括宿主菌、锚定蛋白和靶蛋白，有时在锚定蛋白和靶蛋白之间也添加一段连接(linker)序列。微生物细胞表面展示在多肽分离、全细胞催化剂、全细胞吸附剂、疫苗和抗体生产、蛋白文库筛选、生物传感器、生物修复等方面都有广阔的应用前景。
[0003]目前在微生物表面展示系统中应用比较多的宿主菌主要有噬菌体(Bacteriophages)、酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌(Escherichia.Coli)等)、和革兰氏阳性菌(谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等)。表面展示使用的锚定蛋白一般具有以下特征：(1)较牢固地锚定在细胞表面；(2)可以与靶蛋白序列有效融合而不影响靶蛋白的结构和功能。革兰氏阳性菌展示系统的锚定蛋白主要有：(1)膜相关蛋白(具有跨膜结构域或脂蛋白)；(2)细胞壁相关蛋白(具有C末端Leu
‑
Pro
‑
X
‑
Thr
‑
Gly(LPXTG)基序或细胞壁结合结构域(CWBD))。
[0004]谷氨酸棒杆菌具有鲁棒性强、较低的细胞外蛋白酶活性、广泛的天然碳源底物等优点，在微生物细胞表面展示方面的应用具有非常广阔的前景。目前，谷氨酸棒杆菌的展示系统可用的锚定蛋白较少，仅具有三种类型：外源蛋白(PgsA)，霉菌酰化蛋白(Ncgl1337，孔蛋白系列蛋白PorB、PorC)和膜蛋白(NCgl1221，又名机械通道蛋白MscCG)。目前这些锚蛋白已将许多种酶蛋白，例如淀粉酶，葡聚糖酶，葡糖苷酶，纤维素酶复合物等成功地展示在谷氨酸棒杆菌表面。为增加谷氨酸棒杆菌细胞表面展示技术的多功能性，有必要开发新的和有效的锚定基序。
[0005]Choi等(Choi J W,Yim S S,Jeong K J.Development of a potential protein display platform in Corynebacterium glutamicum using mycolic acid layer protein,NCgl1337,as an anchoring motif[J].Biotechnology Journal,2017:1700509.)报道了利用谷氨酸棒杆菌霉菌酸层蛋白Ncgl1337作为锚定蛋白进行外源蛋白的细胞表面展示。Yao等(Display of alpha
‑
amylase on the surface of Corynebacterium glutamicum cells by using NCgl1221 as the anchoring protein,and production of glutamate from starch.Archives of Microbiology.2009)报道了利用谷氨酸棒杆菌膜蛋白NCgl1221作为锚定蛋白进行外源蛋白的细胞表面展示。但目前谷氨酸棒杆菌的锚定蛋白的种类和数量较少，展示体系较为单一。

技术实现思路

[0006]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供编码所述谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307的基因。
[0008]本专利技术的又一目的在于提供一种谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统。
[0009]本专利技术的再一目的在于提供所述谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法。
[0010]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0011]一种谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]所述的谷氨酸棒杆菌壁蛋白由366个氨基酸组成，大小约为31.3KDa。
[0013]编码所述谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0014]所述的谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307作为锚定蛋白在表面展示系统中的应用。
[0015]所述的表面展示系统为谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统，所述的谷氨酸棒杆菌壁蛋白Ncgl1307可用于构建谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统，所述的谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统是以所述谷氨酸棒杆菌壁蛋白Ncgl1307为锚定蛋白将靶蛋白固定在谷氨酸棒杆菌细胞表面构成的。
[0016]一种谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统，是以所述的谷氨酸棒杆菌壁蛋白Ncgl1307为锚定蛋白，将靶蛋白固定在谷氨酸棒杆菌细胞表面构成的。
[0017]所述的靶蛋白为荧光蛋白或淀粉酶中的任意一种；优选为增强绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(mCherry)或α
‑
淀粉酶(α
‑
amylase)。
[0018]所述的谷氨酸棒杆菌优选为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
[0019]所述的谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法，包括如下步骤：
[0020](1)将编码所述谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307的基因克隆到表达载体的表达盒中，得到以谷氨酸棒杆菌壁蛋白Ncgl1307为锚定蛋白的表面展示表达载体；
[0021](2)将靶蛋白的基因序列克隆到步骤(1)中得到的表面展示表达载体的谷氨酸棒杆菌壁蛋白Ncgl1307的基因序列的上游，与所述谷氨酸棒杆菌壁蛋白Ncgl1307的基因形成融合基因；
[0022](3)转化谷氨酸棒杆菌，然后根据表达载体上的筛选标记筛选阳性转化子，即得到所述谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统。
[0023]所述的谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法，具体包括如下步骤：
[0024](i)将编码所述谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307的基因、靶蛋白的基因和表达载体通过同源重组的方式，构建得到重组质粒；
[0025](ii)将步骤(i)中得到重组质粒转化谷氨酸棒杆菌，挑取阳性转化子，得到所述谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统。
[0026]步骤(i)中所述的编码所述谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
[0027]步骤(i)中所述的靶蛋白为荧光蛋白或淀粉酶中的任意一种；优选为增强绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(mCherry)或α
‑
淀粉酶(α
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.编码权利要求1所述谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307作为锚定蛋白在表面展示系统中的应用，其特征在于：所述的表面展示系统为谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统。4.一种谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统，其特征在于：是以权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌壁蛋白Ncgl1307为锚定蛋白，将靶蛋白固定在谷氨酸棒杆菌细胞表面构成的。5.根据权利要求4所述的谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统，其特征在于：所述的靶蛋白为荧光蛋白或淀粉酶中的任意一种。6.根据权利要求5所述的谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统，其特征在于：所述的靶蛋白为增强绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或α
‑
淀粉酶。7.权利要求4～6任一项所述的谷氨酸棒杆菌细胞表面展示系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将编码权利要求1所述谷氨酸棒杆菌蛋白Ncgl1307的基因克隆到表达载体的表达盒中，得到以谷氨酸棒杆菌壁蛋白Ncgl1307为锚定蛋白的表面展示表达载体；(2)将靶蛋白的基因序列克隆到步骤(1)中得到的表面展示表达载体的谷氨酸棒杆菌壁蛋白Ncgl1307的基因序列的上游，与所述谷氨酸棒杆菌壁蛋白Ncgl1307的基因形成融合基因；(3)转...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑穗平，林珂瑞，韩双艳，林影，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：