维生素D受体基因SNP位点检测试剂制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及维生素D受体基因SNP位点检测试剂。本发明专利技术所述的检测试剂包括裂解液和检测引物。其中裂解液中不含有蛋白酶K，在保证提取效果的前提下，缩短裂解液提取样本核酸的周期，降低裂解液成本。并且，本发明专利技术针对VDR基因的rs1544410、rs7975232、rs2228570、rs731236四个SNP位点设计引物，四个SNP位点测试使检测结果更为准确、可靠。可靠。

【技术实现步骤摘要】
维生素D受体基因SNP位点检测试剂


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及维生素D受体基因SNP位点检测试剂。

技术介绍

[0002]钙是人体骨骼和牙齿的主要成份之一，大部分以离子形式存在，是人体重要的组成物质之一。维生素D被称为“钙的搬运工”，其最主要功能是帮助钙质被人体吸收。在儿童期，适宜剂量的维生素D是保证生长发育的重要因素。所谓的儿童“缺钙”，其实是维生素D缺乏。维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)基因，编码了维生素D的受体蛋白，决定钙的吸收和在骨骼中的储存和流失速度。VDR的表达状态影响儿童骨密度发育，表达不足或异常的人群有骨质疏松的风险。
[0003]单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每300个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。同样VDR基因存在大量的SNP位点，据调查研究，部分位点与儿童钙的吸收存在较大的关联，因此检测儿童VDR基因的SNP位点能够对将来可能存在的缺钙情况进行预测，对儿童成长发育过程中钙的补充具有参考指导意义。
[0004]目前检测单核苷酸多态性的常用方法有PCR
‑
RFLP、基因芯片等方法，不论哪种方法，对于样品的前处理过程都是非常重要的。儿童取样除其他因素外，还需要考虑儿童的顺应性。相对于其他样品而言，口腔样本取样方便，痛苦较小，适合作为儿童基因检测的样品。但该样品组成较为复杂，前处理不当，所得DNA污染严重或片段不完整都会影响到检测结果的准确性。因此，开发更合理的DNA提取试剂，提高样品的前处理效果，是非常重要的。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供维生素D受体基因SNP位点检测试剂。所述试剂中的裂解液即便不添加蛋白酶K，也能够对口腔细胞起到良好的裂解效果。
[0006]本专利技术提供的维生素D受体基因SNP位点的检测试剂包括，检测引物和样品裂解液；所述裂解液包括水、Tris
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HCl、Tween、Triton X
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100和EDTA。
[0007]目前常用的裂解液中多含有蛋白酶K成分，利用蛋白酶K对细胞进行裂解需要于37℃孵育，增加了裂解的步骤。且为了维持蛋白酶K的活性，需要低温冷藏和运输给存储和运输带来了不便。而如果在纯化过程中没有完全将蛋白酶K除去，则会影响后期的扩增反应。本专利技术所述裂解液中不含有蛋白酶K也能够对口腔细胞起到良好的裂解效果。其中，所述Tris
‑
HCl的pH值为8.3。该裂解液中，以吐温和Triton X
‑
100作为去污剂，从而起到良好的裂解作用。经验证，选择吐温
‑
20的裂解效果由于其他吐温系列的表面活性剂。其中吐温
‑
20与Triton X
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100的质量比优选为8:1，当吐温
‑
20与Triton X
‑
100在该比例下时，裂解所得产物的扩增效果最优。
[0008]本专利技术中，所述裂解液由水和如下组分组成：
[0009]10～30mM Tris
‑
HCl，0.5wt％～1wt％Tween、0.01wt％～1wt％Triton X
‑
100和1～20mM EDTA。
[0010]一些实施例中，所述裂解液由水和如下组分组成：20mM Tris
‑
HCl，0.8wt％Tween
‑
20、0.1wt％Triton X
‑
100和10mMEDTA。
[0011]本专利技术中，所述检测引物为靶向VDR基因的rs1544410、rs7975232、rs2228570和/或rs731236SNP位点中至少一种。一些实施例中，所述检测引物包括：如SEQ ID NO:1～2所示的两条长片段引物；和SEQ ID NO:3～4所示的两条长片段引物。具体的，检测引物包括：
[0012]长片段引物：F：ACTGCTTGGAGTGCTCCTCAT
[0013]R：CTACTTTGCTGGTTTGCAGAGCC
[0014]短片段引物：F：AAAGACAGAGACCCACACAGCAAC
[0015]R：CATGCTCTGAGCCAGCTATGT
[0016]本专利技术所述的检测试剂中，还包括BSA溶液。所述牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白的浓度为20mg/mL。所述牛血清白蛋白溶液的体积与所述核酸裂解液的体积比为4：200。
[0017]本专利技术所述的检测试剂中，还包括口腔拭子和离心管。
[0018]所述口腔拭子用于口腔取样。所述离心管作为前处理的容器。
[0019]本专利技术还提供给了维生素D受体基因SNP位点的检测方法，其以本专利技术所述的检测试剂对口腔样品进行检测。
[0020]本专利技术所述的检测方法包括样品前处理和PCR扩增两个步骤。
[0021]所述前处理包括：将待提取的样品与所述的裂解液混合，经涡旋振荡后，与牛血清白蛋白溶液混合，再次经涡旋振荡后，60～70℃孵育8～12min后，再经90～100℃孵育4～6min，经离心后获得含有核酸的上清液。
[0022]本专利技术中，所述所述待提取样品为口腔拭子，所述核酸为基因组DNA。
[0023]在该提取方法中，每份口腔拭子与200μL所述裂解液混合。
[0024]所述牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白的浓度为20mg/mL，所述牛血清白蛋白溶液的体积与所述核酸裂解液的体积比为4：200。
[0025]所述60～70℃孵育前经瞬时离心；所述90～100℃孵育前也经瞬时离心。所述离心为以12000转/分钟，离心5分钟。
[0026]一些实施例中，所述孵育的包括65℃孵育10min后，再经95℃孵育5min。
[0027]所述PCR扩增的体系包括：前处理后获得的模板DNA 4μl、5
×
HS Taq buffer 4μl、F Primer(10μM)0.5μl、R Primer(10μM)0.5μl、HOT Start Taq DNA polymerse 0.1μl、dNTP 0.4μl，灭菌水定容至20μl。
[0028]所述PCR扩增的条件包括：
[0029][0030]本专利技术所述的检测试剂包括裂解液和检测引物。其中裂解液中不含有蛋白酶K，在
保证提取效果的前提下，缩短裂解液提取样本核酸的周期，降低裂解液成本。并且，本专利技术针对VDR基因的rs1544410、rs7975232、rs2228570、rs731236四个SNP位点设计引物，四个SNP位点测试使检测结果更为准确、可靠。
附图说明
[0031]图1示长片段电泳图谱；从左到右，前3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.维生素D受体基因SNP位点的检测试剂，其包括，检测引物和样品裂解液；所述裂解液包括水、Tris
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HCl、Tween、Triton X
‑
100和EDTA。2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述裂解液由水和如下组分组成：10～30mM Tris
‑
HCl，0.5wt％～1wt％Tween、0.01wt％～1wt％Triton X
‑
100和1～20mM EDTA。3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述裂解液由水和如下组分组成：20mM Tris
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HCl，0.8wt％Tween
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20、0.1wt％Triton X
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100和10mM EDTA。4.根据权利要求1～3任一项所述的检测试剂，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵久茗，刘一丁，王江，
申请(专利权)人：成都诺森医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：