一种位点特异性标记RNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种位点特异性标记RNA的方法，涉及RNA合成和标记领域，包括设计并制备RNA先导链；设计并制备DNA双链模板；位点特异性标记RNA；向固－液混合相反应体系中加入含修饰的或普通的核苷酸(NTPs)，在RNA先导链的3

【技术实现步骤摘要】
一种位点特异性标记RNA的方法


[0001]本专利技术涉及RNA合成和标记领域，尤其涉及一种位点特异性标记RNA的方法。

技术介绍

[0002]RNA在生命活动中承担至关重要的信息传递和生物学调控功能，位点特异性标记RNA有着广泛的应用，例如在活细胞内实时观测RNA，增加RNA的稳定性，提高RNA药物和疫苗的有效性。
[0003]固相化学合成法是目前普遍合成及标记RNA的手段，但是这种方法的主要局限是合成RNA的长度不超过100碱基(nt)。2015年Nature报道的PLOR(Position
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selective labeling of RNA，位点特异性标记RNA)方法通过限制核苷三磷酸(NTPs)，精确控制RNA聚合酶的转录进程，实现在转录过程中对RNA链的位点特异性标记。然而，该方法无法实现对RNA序列中连续多个相同碱基中的某个或某些位点进行精确位点标记，而且，采用该方法标记长链RNA(>100nt)靠近3
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端的位点效率不高，一般低于10％。
[0004]到目前为止，尚未有位点特异性标记长链RNA(>100nt)的方法能够：1.标记位点的碱基类型不受限制，对A、C、G、U四种碱基均可标记；2.可对单碱基重复区域中的精确位点进行标记；3.标记位点不受RNA折叠后结构的限制。
[0005]因此，本领域的技术人员致力于开发一种可标记位点的碱基类型不受限制、可标记单碱基重复片段中某一个或某几个位点、标记的位点不受复杂高级结构的局限的位点特异性标记RNA方法。

技术实现思路

[0006]鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是一种位点特异性标记RNA的手段，该方法实现了灵活标记RNA的指定位点：可标记位点的碱基类型不受限制；可标记单碱基重复片段中某一个或某几个位点；标记的位点不受复杂高级结构的局限，可以位于单链或双链区域。以此解决现有技术中尚未有普遍适用于长链RNA位点特异性标记的难题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种位点特异性标记RNA的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1、设计并制备RNA先导链；选取目标RNA的5
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端到标记位点之前的序列作为RNA先导链的序列，通过体外转录法、PLOR等方法合成RNA先导链；
[0009]步骤2、设计并制备DNA双链模板，DNA双链模板为包括两端碱基互补配对区域和中间碱基非互补配对区域的双链DNA；碱基非配对区域称为“空泡”区域；DNA双链包括两条链，分别为编码链和非编码链；编码链和非编码链在除“空泡”区域之外的区域里均为碱基互补配对；编码链的“空泡”区域与步骤1获得的RNA先导链的3
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端通过碱基互补配对；非编码链的5
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端标记生物素，将DNA双链模板固定在链霉亲和素附着的琼脂小球上，得到小球固定的DNA双链；
[0010]步骤3、位点特异性标记RNA：步骤1获得的RNA先导链、步骤2获得的小球固定的DNA
双链以及RNA聚合酶在反应管中孵育，使三者在30～37℃下，形成稳定的“RNA聚合酶
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DNA模板
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RNA先导链”三元复合物，形成固－液混合相反应体系；
[0011]步骤4、向步骤3获得的固－液混合相反应体系中加入含修饰的或普通的NTPs，NTPs在RNA先导链的3
’
端进行转录延伸，实现精确位点标记。
[0012]进一步地，上述步骤1还包括：对于具有复杂结构的RNA先导链，设计短链DNA，将具有复杂结构的RNA先导链与短链DNA链杂交。
[0013]进一步地，上述步骤1还包括：通过软件预测具有复杂结构的RNA先导链的结构，根据预测到的结构设计短链DNA的序列，通过杂交破坏具有复杂结构的RNA先导链的折叠，释放具有复杂结构的RNA先导链的3
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端，具有复杂结构的RNA先导链的3
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端碱基数大于4nt。
[0014]进一步地，RNA先导链的种类包括：i.天然无修饰RNA链；ii.DNA链辅助折叠的RNA链；iii.带有修饰基团的RNA链。
[0015]进一步地，编码链和非编码链在使用前需要先进行杂交和固定。
[0016]进一步地，杂交和固定的方法为：等量编码链和非编码链在40mM Tris
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HCl，6mM MgSO4溶液中95℃加热5min，室温冷却；1nmole的DNA双链与20uL 50％的琼脂糖小球在40mM Tris
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HCl，6mM MgSO4中孵育1h；采用固液相分离法滤除未被固定的DNA后，加入40mM Tris
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HCl，6mM MgSO4重悬小球固定的DNA双链，4℃储存备用。
[0017]进一步地，上述步骤4还包括：将NTPs分成多次加入，精确控制在固
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液混合相反应体系中转录延长RNA先导链的进程，并将修饰基团引入到RNA的指定位点上，确保RNA的延长分多步骤、可控地进行。
[0018]进一步地，上述步骤4还包括：根据标记位点的需要，在某一次或某几次加入的NTPs中含有带修饰基团的NTPs，将其合成入RNA中；引入的修饰基团包括：荧光基团、化学活性官能团、天然修饰、重原子、旋转标签。
[0019]进一步地，上述步骤4中NTPs加入反应体系的次序和种类由DNA模板链的序列决定；除最后一次之外，每次加入的NTPs种类不超过3种。
[0020]进一步地，上述方法还包括采用紫外、荧光凝胶电泳法和HPLC对合成的荧光修饰的RNA或者标记的RNA产物进行检测和纯化；荧光修饰的RNA和标记的RNA产物中RNA的长度为小于、等于或者大于100个碱基。
[0021]进一步地，DNA模板通过与固定相结合进行固定。
[0022]进一步地，往固－液相转录复合物中加入NTPs，延长RNA先导链。
[0023]进一步地，加入的RNA先导序列可为：天然RNA；功能化修饰的RNA链；通过与DNA链杂交改变其自身折叠的RNA链。
[0024]在本专利技术的较佳实施方式中，详细说明在长链RNA重复碱基区域进行精确位点标记的过程；
[0025]在本专利技术的另一较佳实施方式中，详细说明位点特异性标记具有复杂结构RNA先导链的长链RNA的过程。
[0026]本专利技术涉及合成和标记RNA，具体涉及通过DNA链杂交改变RNA先导链的折叠，在固
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液相转录反应中，通过控制NTPs的加入来精确控制RNA先导链的延伸，特别地，在此过程中对RNA进行位点特异性标记。应用本专利技术的技术方案，通过形成固－液相转录延伸复合物，延伸RNA先导链的3
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端，在固
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液相转录延伸过程中进行位点特异性标记。本专利技术可标
记的RNA长度不受限制，可用于短链和长链RNA的标记，可广泛用于RNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种位点特异性标记RNA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、设计并制备RNA先导链；选取目标RNA的5
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端到标记位点之前的序列作为所述RNA先导链的序列，通过包括体外转录法、位点特异性标记RNA即PLOR法合成所述RNA先导链；步骤2、设计并制备DNA双链模板，所述DNA双链模板为包括两端碱基互补配对区域和中间碱基非互补配对区域的双链DNA；所述碱基非配对区域称为“空泡”区域；所述DNA双链包括两条链，分别为编码链和非编码链；所述编码链和所述非编码链在除所述“空泡”区域之外的区域里均为碱基互补配对；所述编码链的所述“空泡”区域与步骤1获得的RNA先导链的3
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端通过碱基互补配对；所述非编码链的5
’
端标记生物素，将所述DNA双链模板固定在链霉亲和素附着的琼脂小球上，得到小球固定的DNA双链；步骤3、位点特异性标记RNA：步骤1获得的RNA先导链、步骤2获得的小球固定的DNA双链以及RNA聚合酶在反应管中孵育，使三者在30～37℃下，形成稳定的“RNA聚合酶
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DNA模板
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RNA先导链”三元复合物，形成固－液混合相反应体系；步骤4、向步骤3获得的固－液混合相反应体系中加入含修饰的或普通的NTPs，所述NTPs在所述RNA先导链的3
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端进行转录延伸，实现精确位点标记。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1还包括：对于具有复杂结构的所述RNA先导链，设计短链DNA，将所述具有复杂结构的所述RNA先导链与所述短链DNA链杂交。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1还包括：通过软件预测所述具有复杂结构的所述RNA先导链的结构，根据预测到的所述结构设计所述短链DNA的序列，通过杂交破坏所述具有复杂结构的所述RNA先导链的折叠，释放所述具有复杂结构的所述RNA先导链的3
’
端，所述具有复杂结构的所述RNA先导链的3...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘昱，王思雨，陈典，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：