石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提出一种石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用，属于生物传感器技术领域。本发明专利技术提出的生物传感器在整个过程中可只利用一段DNA序列修饰金电极表面，并且不需要对DNA进行额外的任何修饰。该传感器体系稳定，操作简单，可便捷快速地对待检溶液中的甲基化转移酶以定性、定量的方式进行判断，实现甲基化转移酶检测限可达0.7U/mL。现甲基化转移酶检测限可达0.7U/mL。现甲基化转移酶检测限可达0.7U/mL。

【技术实现步骤摘要】
石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物传感器
，尤其涉及一种石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]甲基化使甲基从CpG二核苷酸中的腺苷甲硫氨酸(SAM)转移到胞嘧啶的C
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5位置。DNA甲基化是DNA甲基化转移酶(methyl transferase，DNMT)参与的一种化学修饰过程，在DNMT催化下，通过S
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腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基，将甲基转移到相应碱基上。
[0003]在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在CpG岛5'端胞嘧啶上，生成为5'甲基胞嘧啶。CpG岛为富含G、C碱基的DNA区域，主要位于基因的启动子。人类的CpG以2种形式存在，在正常组织中，一种分散于DNA中，多被甲基化修饰；另一种是CpG结构过度聚集的CpG岛，后者常以非甲基化状态存在于启动子区间。在正常细胞中，跨越启动子区域的CpG二核苷酸大多未甲基化，而异常的DNA甲基化可导致基因表达的转录沉默。
[0004]DNA甲基化在基因表达、基因印记、胚胎发育等多种生物学过程中起着至关重要的作用，而甲基化DNA的过表达与各种癌症密切相关。在肿瘤抑制基因启动子区域的肿瘤类型特异性高甲基化已经被观察到，并与癌症亚型相关。在哺乳动物中，DNA甲基化几乎只发生在CpG二核苷酸中，DNA甲基转移酶催化甲基从s
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腺苷蛋氨酸转移到胞嘧啶。因此，如何能够利用传感器便捷快速地通过读出电信号变化的方式来判断甲基化转移酶是否存在，这对于本领域技术人员而言将是前瞻性的。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用，该传感器可便捷快速地判断甲基化转移酶是否存在，并可以定性、定量的方式实现对甲基化转移酶的识别。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用，包括以下步骤：
[0007]对金电极进行清洁预处理；
[0008]将核苷酸序列固定在金电极上并用巯基己醇对核苷酸序列未与金电极结合部分进行封闭，得到固定有核苷酸序列的金电极；
[0009]将所得固定有核苷酸序列的金电极进行甲基化敏感型限制性核酸内切酶处理，利用末端转移酶延伸，并浸入含有氧化石墨烯的缓冲液中充分作用，得到石墨烯修饰的电化学生物传感器。
[0010]在上述步骤中，限制性内切酶是序列特异性的DNA酶，其通过将未受保护的入侵DNA裂解成小片段来阻止外源DNA在细菌细胞中的表达。上述步骤中使用的是甲基化敏感的限制性核酸内切酶，其特异性识别5'
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CCGG
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3'序列。当识别位点中存在甲基化核苷酸时，则不会被甲基化敏感的限制性核酸内切酶识别。
[0011]末端脱氧核糖核酸转移酶催化探针DNA的3'
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OH端，实现DNA的生长，并得到生长产物长单链DNA，该催化作用不需要模板，具有制备工艺极其简单、设计灵活和多功能应用等特点。
[0012]氧化石墨烯是一种单原子厚度的二维碳材料，具有导热系数高、机械强度强、电子输运性能好、表面积大等优异特性。氧化石墨烯可以吸附单链DNA，吸附氧化石墨烯的单链DNA修饰电极相比于未吸附氧化石墨烯的单链DNA修饰金电极，其电极阻抗发生明显变化。
[0013]作为优选，所述核苷酸序列为含有CpG序列5'
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CCGG
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3'，且所述核苷酸序列两端修饰有巯基。
[0014]作为优选，将核苷酸序列固定在金电极上并用巯基己醇对核苷酸序列未与金电极结合部分进行封闭具体为：
[0015]将核苷酸序列液与三(2
‑
羧乙基)膦混合均匀，加入干燥的金电极，室温下浸泡10
‑
12小时后，取出，干燥，得到固定有核苷酸序列的金电极；
[0016]将固定有核苷酸序列的金电极浸入巯基己醇溶液中，室温下浸泡1
‑
2小时，以封闭核苷酸序列未与金电极结合部分。
[0017]作为优选，所加入的核苷酸序列液的浓度为1μM，三(2
‑
羧乙基)膦的浓度为10mM。
[0018]作为优选，将所得固定有核苷酸序列的金电极进行甲基化敏感型限制性核酸内切酶处理，利用末端转移酶延伸，并浸入含有氧化石墨烯的缓冲液中充分作用的步骤具体为：
[0019]将所得固定有核苷酸序列的金电极浸入含有甲基化敏感型限制性核酸内切酶的10mM第一Tris
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HCl缓冲溶液中，于温度36
‑
38℃处理60
‑
70分钟，得到第一中间电极；
[0020]将所得中间电极用PBS缓冲液冲洗后，随即浸入含有40U/mL TdTase和10μM dNTP或dATP的20mM第二Tris
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HCl缓冲液中，于36
‑
38℃下处理60
‑
70分钟，得到第二中间电极；
[0021]将所得第二中间电极冲洗后，浸入含有100ppm氧化石墨烯的20mM第二Tris
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HCl缓冲液中，于温度36
‑
38℃处理60
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70分钟，得到石墨烯修饰的电化学生物传感器。
[0022]作为优选，所述第一Tris
‑
HCl缓冲溶液的pH＝7.4，由50mM NaCl、10mM MgCl2、1mM DTT组成，所述第二Tris
‑
HCl缓冲溶液的pH＝7.4，由50mM NaCl、10mM MgCl2组成。
[0023]本专利技术还提供了一种根据上述技术方案任一项所述的制备方法制备得到的石墨烯修饰的电化学生物传感器。
[0024]本专利技术还提供了一种根据上述技术方案所述的石墨烯修饰的电化学生物传感器在甲基化转移酶检测中的应用，其能够在0.7
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12U/mL范围内对甲基化转移酶进行检测。
[0025]作为优选，应用时，在检测的缓冲体系中存在有甲基化转移酶时，其能够催化金电极上固定的核苷酸序列中的CpG序列5'
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CCGG
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3'甲基化，导致甲基化敏感型限制性核酸内切酶无法进行催化及后续反应，所检测得到的经甲基化转移酶修饰过的电极阻抗也会明显大于石墨烯修饰的电化学生物传感器的电极阻抗，以达到检测目的。
[0026]作为优选，在检测时，将所得固定有核苷酸序列的金电极浸入含有甲基化转移酶的10mM第三Tris
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HCl缓冲液中于温度36
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38℃甲基化75
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85分钟；
[0027]其中，所述第三Tris
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HCl缓冲液的pH＝7.4，由50mM NaCl、10mM MgCl2、1mM DTT和160μM SAM组成，所加入的甲基化转移酶的浓度为40本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.石墨烯修饰的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：对金电极进行清洁预处理；将核苷酸序列固定在金电极上并用巯基己醇对核苷酸序列未与金电极结合部分进行封闭，得到固定有核苷酸序列的金电极；将所得固定有核苷酸序列的金电极进行甲基化敏感型限制性核酸内切酶处理，利用末端转移酶延伸，并浸入含有氧化石墨烯的缓冲液中充分作用，得到石墨烯修饰的电化学生物传感器。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核苷酸序列为含有CpG序列5'
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CCGG
‑
3'，且所述核苷酸序列两端修饰有巯基。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将核苷酸序列固定在金电极上并用巯基己醇对核苷酸序列未与金电极结合部分进行封闭具体为：将核苷酸序列液与三(2
‑
羧乙基)膦混合均匀，加入干燥的金电极，室温下浸泡10
‑
12小时后，取出，干燥，得到固定有核苷酸序列的金电极；将固定有核苷酸序列的金电极浸入巯基己醇溶液中，室温下浸泡1
‑
2小时，以封闭核苷酸序列未与金电极结合部分。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所加入的核苷酸序列液的浓度为1μM，三(2
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羧乙基)膦的浓度为10mM。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将将所得固定有核苷酸序列的金电极进行甲基化敏感型限制性核酸内切酶处理，利用末端转移酶延伸，并浸入含有氧化石墨烯的缓冲液中充分作用的步骤具体为：将所得固定有核苷酸序列的金电极浸入含有甲基化敏感型限制性核酸内切酶的10mM第一Tris
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HCl缓冲溶液中，于温度36
‑
38℃处理60
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70分钟，得到第一中间电极；将所得中间电极用PBS缓冲液冲洗后，随即浸入含有40U/mL TdTase和10μM dNTP或dATP的20mM第二Tris
‑
HCl缓冲液中，于36
‑
38℃下处...

【专利技术属性】
技术研发人员：李昉，刘树峰，盖兆荣，刘学谦，张小凡，李坤浩，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：