快速检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂盒及方法，具体的地，本发明专利技术经过多轮筛选验证，从大量引物探针组合中获得了灵敏度高、特异性强、重复性好，能够适配多种快速实时荧光定量PCR平台，并且能够进行多重检测的引物探针组合。引物探针组合。

【技术实现步骤摘要】
快速检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本专利技术涉及一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒引起的一种高度传染性疾病，致死率接近100％。1921年在非洲肯尼亚第一次被报道，由非洲野猪传给家猪。该病爆发可直接冲击猪养殖业，尤其对以猪肉为主要蛋白质来源的地区，造成猪肉价格上涨。根据OIE制定的《陆生动物卫生法典》年版，被列为法定报告的疫病之一。该病毒传播速度快、传播范围广不受猪品种和年龄限制，感染非洲猪瘟病毒的家猪会出现致命的出血热，目前尚无有效的疫苗可进行防御。
[0003]对疾病控制的唯一的可用方法是对疫区的隔离同时对疫区内的猪进行屠宰然后无害化销毁。非洲猪瘟病毒是一种急性、烈性传染病毒，早发现、早处理尤为重要。目前，市场已有的非洲猪瘟核酸检测方法对实验环境要求较高，检测时间较长，无法进行现场检测。因此亟需研发出一种灵敏度高、特异性好且可现场快速检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。
[0004]目前检测非洲猪瘟病毒的主要技术有实时荧光PCR技术，高通量测序技术，抗原抗体免疫荧光技术等。实时荧光PCR技术是目前最常用的病原体核酸检测技术，常规的荧光定量PCR检测试剂存在对检测人员技术要求高、对实验设备适应性差、检测时间长等问题，导致核酸检测结果稳定性较差、而且检测效率较低。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供了一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂盒及方法，具有检测结果稳定性好，适用多种快速实时荧光PCR平台等优点。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供了一种用于快速检测非洲猪瘟病毒的引物对集，所述引物对集包括：
[0007]第一引物对，所述第一引物对包括：
[0008]如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
[0009]在另一优选例中，所述引物对集还包括：
[0010]内标引物对，所述内标引物对包括：
[0011]如SEQ ID NO.3所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.4所示的反向引物。
[0012]本专利技术的第二方面，提供了一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的探针集，所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的第一探针。
[0013]在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内标探针。
[0014]在另一优选例中，各探针的5
’
端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3
’
端包含有荧光淬灭基团。
[0015]在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。
[0016]本专利技术的第三方面，提供了一种快速检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术第一方面所述的引物对集。
[0017]在另一优选例中，所述试剂盒还包括本专利技术第二方面所述的探针集。
[0018]在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多重组分：qPCR缓冲液(qPCR
‑
Buffer)、无核酸酶水、ASFV裂解试剂、阳性质控品、内标溶液、dNTP mix、热启动酶。
[0019]在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.1
‑
6所示的多核苷酸。
[0020]在另一优选例中，所述第一容器还包含(NH4)2SO4、KCl、Tris
‑
HCl、和MgCl2。
[0021]在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含dNTP混合物。
[0022]在另一优选例中，所述第二容器还包含PCR反应酶系，所述PCR反应酶系包括热启动酶。
[0023]在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阴性质控品。
[0024]在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阳性质控品。
[0025]在另一优选例中，所述试剂盒还包括第五容器，所述第四容器内包含ASFV裂解试剂。
[0026]在另一优选例中，所述试剂盒还包括第六容器，所述第六容器内包含纯水。
[0027]在另一优选例中，所述试剂盒使用过程中，配置反应体系中含热启动酶4U；Mg
2+
浓度为5mM时；正向引物浓度为10pmol；反向引物浓度为10pmol；和/或探针浓度为5pmol。
[0028]本专利技术的第四方面，提供了一种快速检测非洲猪瘟病毒的方法，所述方法包括步骤：
[0029](1)提供待检测对象的核酸样本；
[0030](2)制备快速实时荧光定量PCR反应体系并进行PCR检测：
[0031]其中，所述快速实时荧光PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本专利技术第一方面所述的引物对集、和本专利技术第二方面所述的探针组。
[0032]在另一优选例中，所述核酸样本可来自猪组织样本、猪体液样本(如血液样本)、猪粪便样本或环境样本(如饲料、污水样品)。
[0033]在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
[0034]在另一优选例中，所述快速实时荧光定量PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。
[0035]在另一优选例中，所述快速实时荧光定量PCR反应体系还包括PCR反应酶系。
[0036]在另一优选例中，所述快速实时荧光定量PCR反应体系中含热启动酶4U；Mg
2+
浓度为5mM时；正向引物浓度为10pmol；反向引物浓度为10pmol；和/或探针浓度为5pmol。
[0037]在另一优选例中，所述快速实时荧光定量PCR反应程序为95℃，2min；95℃，5s，56℃，20s，45个循环。
[0038]本专利技术的第五方面，提供了本专利技术第一方面所述的引物对集、和/或本专利技术第二方面所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测非洲猪瘟病毒核酸。
[0039]在另一优选例中，所述PCR为快速实时荧光定量PCR。
[0040]应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具
体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0041]图1A、图1B、图1C为检测非洲猪瘟PCR反应管阴性对照的PCR结果(分别为QuantStudio
TM7
、Bio
‑
Rad CFX 96Deep well Dx System、AGS8830)。
[0042]图2A、图2B、图2C为检测非洲猪瘟PCR反应管阳性对照的PCR结果(分别为QuantStudio
TM7
、Bio
‑
Rad CFX本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测非洲猪瘟病毒的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：第一引物对，所述第一引物对包括：如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。2.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：内标引物对，所述内标引物对包括：如SEQ ID NO.3所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.4所示的反向引物。3.一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的探针集，其特征在于，所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的第一探针；优选地，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内标探针。4.一种基于快速实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求3所述的探针集。6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多重组分：qPCR缓冲液(qPCR
‑
Buffer)、无核酸酶水、ASFV裂解试剂、阳性质控品、内标溶液。7.如权利要求4所述的试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，徐小解，朱小亚，刘倩晴，王燕灵，
申请(专利权)人：广州达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：