基于MIRA技术快速检测霍乱弧菌的方法、引物组、胶体金试纸条及试剂盒技术

本申请公开一种基于MIRA技术快速检测霍乱弧菌的方法、引物组、胶体金试纸条及试剂盒。本发明专利技术针对霍乱弧菌ompW基因设计引物与探针，采用胶体金试纸条对霍乱弧菌进行检测，本发明专利技术具有快速、便捷、灵敏度高、特异性好及精确定量的优点。的优点。的优点。

【技术实现步骤摘要】
基于MIRA技术快速检测霍乱弧菌的方法、引物组、胶体金试纸条及试剂盒


[0001]本申请涉及微生物检测
，具体而言，涉及一种基于MIRA技术快速检测霍乱弧菌的方法、引物组、胶体金试纸条及试剂盒。

技术介绍

[0002]霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是革兰氏阴性菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜。共分为139个血清群，其中O1群和O139群可引起霍乱。霍乱弧菌是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一，曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高，属于国际检疫传染病。
[0003]目前用于检测霍乱弧菌的方法有很多，例如，专利CN105603091A公开了一种霍乱弧菌多重荧光PCR检测试剂盒，针对霍乱弧菌溶血素基因设计PCR引物，检测限为1
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103copy/ml，特异性高，但存在需要专用仪器设备、专业人员，耗时长等问题。专利CN106957917A公开了一种环介导等温扩增结合侧向层析技术检测霍乱弧菌的方法，实现了100拷贝的霍乱弧菌目的基因的检测，该技术特异性和灵敏度高，但引物设计和筛选较复杂。专利CN106290842A公开了一种胶体金法检测试剂盒，采用以胶体金为标记物的试纸条实现了霍乱弧菌O139血清型的特异性检测，但是灵敏度较低，以定性和半定量为主。而且，现有的霍乱弧菌胶体金试纸条，仅是针对霍乱弧菌O1或者O139群发生特异性反应，其灵敏度仍有待提高。
[0004]我国出入境行业标准采用微生物学方法进行鉴定、检测，通过增菌、分离培养、生化反应、溶血试验等进行分离鉴定。该方法检验周期长，步骤繁琐，不能满足快速检测要求。
[0005]因此，研究简便、快速、灵敏度和特异性高的霍乱弧菌检测方法非常有必要，第一时间检测到致病菌，能及时采取措施来去除和减少以降低消费者食用被霍乱弧菌污染产品的风险，为最前线的食品安全提供坚固的保障，同时为检测部门提供技术支撑。
[0006]多酶恒温快速扩增技术(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification，MIRA)是一种基于常温恒温核酸快速扩增的技术。具有灵敏度高、特异性强、反应时间短等优点；反应组分可做冻干处理，操作简便，易于保存；无需购买价格高昂的专属设备；且可借助生物标记手段、与侧向流动检测技术相结合，在短时间内实现多重检测、以及短时间内检测结果的可视化读取。目前，尚没有基于多酶恒温快速扩增技术检测霍乱弧菌的方法，因此，建立一种基于多酶恒温快速扩增技术、用于霍乱弧菌的检测方法具有重要现实意义。

技术实现思路

[0007]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供基于MIRA技术快速检测霍乱弧菌的方法、引物组、胶体金试纸条及试剂盒，针对霍乱弧菌ompW基因设计引物与探针，对霍乱弧菌进行胶体金试纸条检测，以解决霍乱弧菌检测过程中无法兼具简便、快速、高灵敏度和高特异性的技术问题。
[0008]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种检测霍乱弧菌的引物组和探针，所述引物组包括上游引物ompW
‑2‑
F1和下游引物ompW
‑2‑
R1，序列分别为：
[0009]ompW
‑2‑
F1：
[0010]5'
‑
CGCGGGTATTGCCTCGGTAGTACCTAATGAC
‑
3'(SEQ ID NO.7)，
[0011]ompW
‑2‑
R1：5'
‑
ACATATAGCCAAGCGTTAACCCTAACTGG
‑
3'(SEQ ID NO.10)；
[0012]所述探针为V.C
‑
ompW
‑
NFO2，其序列为：
[0013]5'
‑
AGTAGCGATAAAGTGTTAAACACTCAAAGTGAGTTGGCAGTTAATA
‑
3'(SEQ ID NO.13)。
[0014]进一步，所述下游引物ompW
‑2‑
R1的的5
’
端标记一个修饰基团，所述修饰基团为生物素，修饰后的下游引物ompW
‑2‑
R1序列为：
[0015]5’‑
[biotin]ACATATAGCCAAGCGTTAACCCTAACTGG。
[0016]进一步，所述探针的5'端标记有荧光基团，所述探针的5'端起第30位碱基后插入四氢呋喃THF作为脱碱基位点，所述探针的3'端标记有C3spacer；所述荧光基团选自FAM、Cy3、Cy5、Biotin、FITC中的至少一种。
[0017]进一步，修饰后的探针V.C
‑
ompW
‑
NFO2序列为：
[0018][6FAM]AGTAGCGATAAAGTGTTAAACACTCAAAGT[THF]AGTTGGCAGTTAATA[C3spacer]。
[0019]本专利技术第二方面提供根据第一方面所述的引物组和探针在检测霍乱弧菌中的应用。
[0020]本专利技术第三方面提供一种检测霍乱弧菌的胶体金试纸条，所述试纸条包括底板以及沿底板的长度方向依次粘附在底板上的样品垫、胶体金垫和吸水垫(吸水滤纸)，且所述样品垫、胶体金垫和吸水垫之间依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；所述胶体金垫上设置有相间隔的检测线和质控线，所述检测线靠近样品垫，所述质控线靠近吸水垫；所述胶体金垫上喷涂有链霉亲和素，链霉亲和素可作为受体与扩增产物上修饰的生物素结合，所述检测线标记有可与羟基荧光素(FAM)结合而显色的抗荧光素抗体，所述质控线标记有能与胶体金结合而显色的生物素二抗。
[0021]进一步，所述检测线与质控线之间的间距为0.4
‑
0.6cm，优选为0.5cm。
[0022]本专利技术第四方面提供根据第三方面所述的胶体金试纸条在检测霍乱弧菌中的应用。
[0023]本专利技术第五方面提供根据第一方面所述的引物组和探针、根据第三方面所述的胶体金试纸条在制备用于检测霍乱弧菌的试剂盒上的应用。
[0024]本专利技术第六方面提供一种用于检测霍乱弧菌的试剂盒，含有第一方面所述的引物组和探针和/或第三方面所述的胶体金试纸条。
[0025]本专利技术第七方面提供一种基于MIRA技术快速检测霍乱弧菌的方法，包括以下步骤：
[0026](1)在反应管中加入上游引物、下游引物、探针和缓冲液，充分混合；
[0027]所述上游引物ompW
‑2‑
F1序列为：
[0028]5'
‑
CGCGGGTATTGCCTCGGTAGTACCTAATGAC
‑
3'(SEQ ID NO.7)，
[0029]所述下游引物ompW
‑2‑
R1序列为：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测霍乱弧菌的引物组和探针，其特征在于，所述引物组包括上游引物ompW
‑2‑
F1和下游引物ompW
‑2‑
R1，序列分别为：ompW
‑2‑
F1：CGCGGGTATTGCCTCGGTAGTACCTAATGAC，ompW
‑2‑
R1：ACATATAGCCAAGCGTTAACCCTAACTGG；所述探针为V.C
‑
ompW
‑
NFO2，其序列为：AGTAGCGATAAAGTGTTAAACACTCAAAGTGAGTTGGCAGTTAATA。2.根据权利要求1所述的引物组和探针，其特征在于，所述下游引物ompW
‑2‑
R1的的5
’
端标记一个修饰基团，所述修饰基团为生物素；所述探针的5'端标记有荧光基团，所述探针的5'端起第30位碱基后插入四氢呋喃THF作为脱碱基位点，所述探针的3'端标记有C3spacer；所述荧光基团选自FAM、Cy3、Cy5、Biotin、FITC中的至少一种。3.一种检测霍乱弧菌的胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板以及沿底板的长度方向依次粘附在底板上的样品垫、胶体金垫和吸水垫，且所述样品垫、胶体金垫和吸水垫之间依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；所述胶体金垫上设置有相间隔的检测线和质控线，所述检测线靠近样品垫，所述质控线靠近吸水垫；所述胶体金垫上喷涂有链霉亲和素，链霉亲和素可作为受体与扩增产物上修饰的生物素结合，所述检测线标记有可与羟基荧光素FAM结合而显色的抗荧光素抗体，所述质控线标记有能与胶体金结合而显色的生物素二抗。4.根据权利要求3所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线与质控线之间的间距为0.4
‑
0.6cm。5.根据权利要求1
‑
2任一项所述的引物组和探针、根据权利要求3
‑
4任一项所述的胶体金试纸条在检测霍乱弧菌或制备用于检测霍乱弧菌的试剂盒上的应用。6.一种用于检测霍乱弧菌的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1
‑
2任一项所述的引物组和探针和/或权利要求3
‑
4任一项所述的胶体金试纸条。7.一种基于MIRA技术快速检测霍乱弧菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在反应管中加入上游引物、下游引物、探针和缓冲液，充分混合；所述上游引物ompW
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【专利技术属性】
技术研发人员：李盛杰，周峰，霍光明，吴雨龙，江海涛，吴中平，
申请(专利权)人：南京晓庄学院，
类型：发明
国别省市：