单加氧酶MpdA及其编码基因mpdA以及二者在维生素E前体合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了单加氧酶MpdA及其编码基因mpdA以及二者在维生素E前体合成中的应用。MpdA的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，全长413个氨基酸，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，全长1242bp。MpdA是首次发现的可以催化2,3,6

【技术实现步骤摘要】
单加氧酶MpdA及其编码基因mpdA以及二者在维生素E前体合成中的应用


[0001]本专利技术属于生物高
，涉及单加氧酶MpdA及其编码基因mpdA以及二者在维生素E前体合成中的应用。

技术介绍

[0002]维生素E具有抗氧化、促进性激素分泌、降低心血管疾病等多种生理功能，广泛应用于食品、保健品、化妆品、临床、医药等行业。随着对维生素E需求的不断攀升，仅仅依靠从自然界植物叶片或种子等中提取已远远不能满足人们的需要，市场上80％以上的维生素E来自工业合成。
[0003]目前，维生素E工业合成的主要途径是2,3,5
‑
三甲基氢醌和异植物醇缩合。异植物醇的生物发酵法合成近年来已成功商业化，但是2,3,5
‑
三甲基氢醌仍使用化学合成，包括2,3,6
‑
三甲基苯酚氧化还原法、异佛尔酮法和偏三甲苯氧化还原法等。化学合成效率高，但会带来一些环境问题，例如，催化过程需要重金属和副产物的产生等等。相反，生物合成具有绿色环保、特异性强、生产成本低等特点，在化工合成的中扮演者越来越重要的角色。生物法合成需要特异的微生物或者酶，然而迄今尚无能特异性合成2,3,5
‑
三甲基氢醌的微生物或者酶。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的上述不足，本专利技术提供2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧酶MpdA与其编码基因mpdA以及二者在维生素E前体2,3,5
‑
三甲基氢醌合成中的应用，MpdA酶液或表达MpdA的细胞能将2,3,6
‑
三甲基苯酚转化为2,3,5
‑
三甲基氢醌。
[0005]本专利技术目的可通过如下技术方案实现：
[0006]基因mpdA源自菌株分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)B5
‑
4，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2019088。菌株Mycobacterium neoaurum B5
‑
4能够降解2,6
‑
二甲基苯酚和2,3,6
‑
三甲基苯酚。
[0007]克隆基因mpdA的策略为比较基因组法。通过在LB培养基(酵母粉，5.0g；蛋白胨，10.0g；NaCl，5.0g；去离子水，1L；pH 7)中连续传代获得一株丧失转化2,3,6
‑
三甲基苯酚能力的突变菌株，命名为Mycobacterium neoaurum B5
‑
4M。通过比较菌株B5
‑
4和突变株B5
‑
4M基因组序列，发现突变株B5
‑
4M中丢失了一个约23kb的DNA片段；综合生物信息学预测和实验验证，获得目的基因mpdA，其编码蛋白命名为MpdA。
[0008]把基因mpdA连接于载体pRESQ(van der Geize R,Hessels GI,van Gerwen R,van der Meijden P,Dijkhuizen L.2002.Molecular and functional characterization of kshA and kshB,encoding two components of 3
‑
ketosteroid 9alpha
‑
hydroxylase,a class IA monooxygenase,in Rhodococcus erythropolis strain SQ1.Mol Microbiol 45:1007
–
1018.https://doi.org/10.1046/j.1365
‑
2958.2002.03069.x.)上获得质粒
pMPDA，将质粒pMPDA导入菌株Rhodococcus qingshengii YL
‑
1(CCTCC AB 2017132)(Li C,Zhang J,Wu ZG,Cao L,Yan X,Li SP.2012.Biodegradation of buprofezin by Rhodococcus sp.strain YL
‑
1isolated from rice field soil.J Agric Food Chem 60:2531
–
2537.https://doi.org/10.1021/jf205185n.Chen X,Ji J,Zhao L,Qiu J,Dai C,Wang W,He J,Jiang J,Hong Q,Yan X.2017.Molecular mechanism and genetic determinants of buprofezin degradation.Appl Environ Microbiol 83:e00868
‑
17.https://doi.org/10.1128/AEM.00868
‑
17.)后获得重组菌株YL
‑
mpdA。菌株YL
‑
mpdA的细胞在基础盐MSM培养基(NH4NO3,1.0g；KH2PO4,0.5g；K2HPO4,1.5g；NaCl,1.0g；MgSO4·
7H2O,0.2g；去离子水，1L；pH 7)中能将2,3,6
‑
三甲基苯酚转化为2,3,5
‑
三甲基氢醌，也能将2,6
‑
二甲基苯酚转化为2,6
‑
二甲基氢醌。将菌株YL
‑
mpdA的细胞破碎，含有2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧酶MpdA的破碎液可将2,3,6
‑
三甲基苯酚转化为2,3,5
‑
三甲基氢醌，也能将2,6
‑
二甲基苯酚转化为2,6
‑
二甲基氢醌。
[0009]本专利技术所述的一种2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧酶的编码基因mpdA，包括：
[0010](a)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或
[0011](b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
[0012]本专利技术所述的一种2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧酶蛋白质MpdA，包括：
[0013](a)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
[0014](b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0015]所述的严格条件可为在6
×
SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，再用2
×
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧酶的编码基因mpdA，其特征在于，包括：(a)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧酶活性的蛋白质的核苷酸序列。2.一种2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧酶MpdA，其特征在于，包括：(a)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白质。3.一种含有权利要求1所述的2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧酶的编码基因mpdA的重组表达载体。4.含有权利要求1所述的2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧酶编码基因mpdA的基因工程菌。5.权利要求1所述的2,3,6
‑
三甲基苯酚单加氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫新，纪俊宾，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：