本发明专利技术涉及电化学检测领域，特别涉及用于胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒。本发明专利技术采用方法为电化学发光法，采用吡啶钌作为化学发光标记物具有明显优势，主要表现在：稳定性更好，钌是金属离子，分子量小，不影响抗体的空间位阻。生产过程短，重复性好，检测范围宽。电化学发光反应可控，降低信号采集难度。降低信号采集难度。
【技术实现步骤摘要】
用于胶质纤维酸性蛋白检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
[0001]本专利技术涉及电化学检测领域，特别涉及用于胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒。
技术介绍
[0002]GFAP是胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein)的英文简称，是星形胶质细胞活化的标志物。胶质纤维酸性蛋白。神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种Ⅲ型中间丝状蛋白，以单体形式存在。在人类当中发现有8种同源异构体，相对分子质量介于(40
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53)
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10^3。人类GFAP基因定位于17号染色体长臂2区1带上，由9个外显子和8个内含子组成。
[0003]GFAP主要分布于中枢神经系统的星形胶质细胞，参与细胞骨架的构成并维持其张力强度。其在软骨细胞、成纤维细胞、肌上皮细胞、淋巴细胞、肝星形细胞也有表达。
[0004]检测脑损伤患者血清中的GFAP水平在临床上可用于中枢神经系统损伤范围及预后的生化标志物。而且在神经胶质瘤中的表达也出现异常。可用于反映神经胶质瘤的恶性程度。
[0005]到目前为止，用于检测人血清中GFAP的方法主要有：酶联免疫法(ELISA)和酶促磁微粒化学发光。但灵敏度不高，线性范围较窄，检测时间过长，尤其是抗体处理时间过长，影响了检测效率。
技术实现思路
[0006]检测脑损伤患者血清中的GFAP水平在临床上可用于中枢神经系统损伤范围及预后的生化标志物。而且在神经胶质瘤中的表达也出现异常。可用于反映神经胶质瘤的恶性程度。在中枢神经系统感染患者的血清中的GFAP的浓度出现升高，可以反映中枢神经系统感染预后。
[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种GFAP磁微粒电化学发光试剂盒及其该试剂盒制备与检测方法，具有生产效率高、检测时间短、适用于全自动检测，具有更高的灵敏度、线性范围宽等优点。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了用于胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测的组合物，包括GFAP试剂Ra、GFAP试剂Rb、链霉亲和素超顺磁微球；
[0010]所述GFAP试剂Ra包括含生物素标记的抗GFAP单克隆抗体；
[0011]所述GFAP试剂Rb包括含三联吡啶钌标记的抗GFAP单克隆抗体；
[0012]所述链霉亲和素超顺磁微球包括表面包裹带有链霉亲和素的超顺磁微球，所述磁微球的粒径在1.5～5.0μm。
[0013]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述GFAP试剂Ra中，每个抗体分子表面的生物
素分子标记量为2～5个；所述GFAP试剂Rb中，每个抗体分子表面的钌分子标记量为2～10个。
[0014]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述GFAP试剂Ra的制备方法为：在缓冲液存在的条件下，取抗GFAP单克隆抗体与生物素混合，制得所述GFAP试剂Ra；所述缓冲液包括PH＝6.5
‑
7.4、20mM～200mM的磷酸盐缓冲液或PH＝7.0
‑
8.4、20mM～200mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
[0015]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述GFAP试剂Ra的制备方法为：取2.0mg的用于标记生物素胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体，使用脱盐柱PD10更换缓冲液为磷酸盐缓冲液(PH＝7.8)，使用超滤管浓缩后调整浓度为2.0mg/mL，加入30
‑
80μg的生物素(使用DMF溶解)，混匀反应10
‑
60分钟，使用脱盐柱PD10去除未标记的生物素。使用含0.1
‑
2％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PH＝6.5
‑
7.4)稀释标记生物素的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体到0.2
‑
1mg/L，作为GFAP试剂Ra。
[0016]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述GFAP试剂Rb的制备方法为：在缓冲液存在的条件下，取抗GFAP单克隆抗体与三联吡啶钌混合，制得所述GFAP试剂Rb；所述缓冲液包括PH＝6.5
‑
7.4、20mM～200mM的磷酸盐缓冲液或PH＝7.0
‑
8.4、20mM～200mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
[0017]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述GFAP试剂Rb的制备方法为：取2.0mg的用于标记三联吡啶钌的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体，使用脱盐柱PD10更换缓冲液为磷酸盐缓冲液(PH＝7.8)，使用超滤管浓缩后调整浓度为2.0mg/mL，加入30
‑
80μg的琥珀酰胺三联吡啶钌(使用DMF溶解)，混匀反应30分钟，使用脱盐柱PD10去除未标记的钌。使用含0.1
‑
2％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PH＝6.5
‑
7.4)稀释标记钌的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体到1mg/L，作为GFAP试剂Rb。
[0018]在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术提供的组合物还包括定标品和/或清洗液；所述清洗液包括浓度180mmol/L的三丙胺和浓度100
‑
300mmol/L的磷酸盐缓冲液；或浓度90mmol/L的二丁基乙醇胺和浓度100
‑
300mmol/L的磷酸盐缓冲液。
[0019]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述GFAP试剂Ra、所述GFAP试剂Rb与所述链霉亲和素超顺磁微球的体积比为(50～80)：(50～80)：40。
[0020]在上述研究的基础上，本专利技术还提供了所述的组合物在制备胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒中的应用。
[0021]本专利技术还提供了胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的磁微球电化学发光免疫检测的试剂盒，包括所述的组合物以及检测可接受的试剂。
[0022]本专利技术还提供了胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的磁微球电化学发光免疫检测方法，基于所述的组合物或所述的试剂盒，包括如下步骤：
[0023]步骤1：取样本，依次加入GFAP试剂Ra和GFAP试剂Rb，于37℃孵育9min，最后加入链霉亲和素超顺磁微球，于37℃孵育9min，获得反应液；其中，样本、GFAP试剂Ra、GFAP试剂Rb与链霉亲和素超顺磁微球的体积比为15：(50～80)：(50～80)：40；
[0024]步骤2：将所述反应液用磁铁吸附；
[0025]步骤3：取所述清洗液，清洗未结合到超顺磁微球上的标记钌的抗体和样本，通电，在所述清洗液存在的条件下三联吡啶钌发光；
[0026]步骤4：光记录发光值，根据建立的标准曲线，获得样本中GAFP的浓度。
[0027]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述孵育为于37℃孵育9min。
[0028]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述检测方法具体为：
[0029]步骤1：取样本15ul加入反应管中，再依次加入GFAP本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测的组合物，其特征在于，包括GFAP试剂Ra、GFAP试剂Rb、链霉亲和素超顺磁微球；所述GFAP试剂Ra包括含生物素标记的抗GFAP单克隆抗体；所述GFAP试剂Rb包括含三联吡啶钌标记的抗GFAP单克隆抗体；所述链霉亲和素超顺磁微球包括表面包裹带有链霉亲和素的超顺磁微球，所述磁微球的粒径在1.5～5.0μm。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述GFAP试剂Ra中，每个抗体分子表面的生物素分子标记量为2～5个；所述GFAP试剂Rb中，每个抗体分子表面的钌分子标记量为2～10个。3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述GFAP试剂Ra的制备方法为：在缓冲液存在的条件下，取抗GFAP单克隆抗体与生物素混合，制得所述GFAP试剂Ra；所述缓冲液包括PH＝7.4、20mM～200mM的磷酸盐缓冲液或PH＝7.4、20mM～200mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。4.如权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于，所述GFAP试剂Rb的制备方法为：在缓冲液存在的条件下，取抗GFAP单克隆抗体与三联吡啶钌混合，制得所述GFAP试剂Rb；所述缓冲液包括PH＝7.4、20mM～200mM的磷酸盐缓冲液或PH＝7.4、20mM～200mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。5.如权利要求1至4任一项所述的组合物，其特征在于，还包括定标品和/或清洗液；所述清洗液包括浓度180mmol/L的三丙胺和浓度300mmol/L的磷酸盐缓冲液；或浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦军，谢元东，谢良思，
申请(专利权)人：江苏优尼泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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