三维成纤维细胞集合体及包含此的体外三维皮肤真皮模型制造技术

本发明专利技术提供一种三维成纤维细胞集合体、该细胞集合体的制造方法以及包含由成纤维细胞培养的成纤维细胞集合体的体外(In vitro)三维皮肤真皮模型及使用该模型而筛选药物的方法。法。法。

【技术实现步骤摘要】
三维成纤维细胞集合体及包含此的体外三维皮肤真皮模型
[0001]本申请是申请日为2016年4月19日、申请号为201680003627.X、专利技术名称为“三维成纤维细胞集合体及包含此的体外三维皮肤真皮模型”的专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及一种三维成纤维细胞集合体、该细胞集合体的生产方法、包含该细胞集合体的体外三维皮肤真皮模型以及使用该细胞集合体而筛选药物的方法。

技术介绍

[0003]近来，细胞治疗技术作为难治疾病等的治疗的新领域而受到瞩目。目前为止，为了治疗人类的难治疾病，提出了脏器移植或基因治疗等，但由于免疫排斥、供应脏器不足、载体开发或疾病基因相关知识的不足，未能完成有效的实用化。
[0004]于是，对于细胞治疗技术的关心高涨，且将从生物体内分离的细胞在生物体外进行增殖并移植的技术正在商用化，人工皮肤、软骨或纤维组织的重建等的实用化在持续进行。成纤维细胞为用于生产并维持间质性细胞外基质(ECM)的细胞，成纤维细胞通过细胞外基质而有机地连接。并且，成纤维细胞作为生产免疫防御用的多样的细胞因子及生理活性因子的细胞而广为人知。
[0005]为了将这样的成纤维细胞作为细胞治疗剂或组织工程学素材而灵活利用，以二维方式培养成纤维细胞而大量增殖之后利用胰蛋白酶之类的酶进行了处理，然而在这样的成纤维细胞中，在将生成的细胞外基质分解而移植的步骤中无法期待细胞外基质的作用。作为组织工程学技术，利用可生物分解的合成高分子或天然高分子，并利用被称为支架的人工三维多孔性细胞外基质，而用于将包含成纤维细胞在内的多样的细胞培养成三维细胞集合体的研究曾展开。然而，其中却存在着生物分解速度或炎症反应等素材的限制，因此难以实现商用化，于是需要一种诱导形成三维细胞集合体的技术。
[0006]另一方面，人体的皮肤组织大体分为三个部分，即由形成皮肤的最外侧的表皮层、其下层的真皮层、以及皮下组织所构成。其中，表皮层由从用于使表皮层与真皮层得以牢固结合的基底膜(basement membrane)分化为多层的上皮细胞以及所述上皮细胞外的黑色素细胞、免疫细胞构成。表皮层下方的真皮层主要由成纤维细胞及该细胞所分泌的多种细胞外基质(extracellular matrix)构成。真皮层与皮肤健康及老化密切相关，这一点已周知。
[0007]胶原作为占据真皮层的90％的主要蛋白质，用于维持皮肤结合组织，并提供皮肤弹力。通常，随着外界因素及年龄的增加，成纤维细胞的数量和功能减少，这被周知为是老化的主要原因。细胞的减少引发皮肤组织中的纤维质成分合成及水分的损失、以及角质层的变化。而且，胶原酶的增加使交联形态的胶原减少，这使皮肤的光滑、水分及弹力减小。胶原含量及合成增加意味着皮肤的水分及弹力的增加。
[0008]皮肤基质内的胶原的分解和合成借助于作为蛋白酶的基质金属蛋白酶(MMP；matrix metalloproteinase)而得到调节。根据结构和功能性特性，MMP分为多个种类。I型胶原作为皮肤的典型胶原，由于MMP
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1的作用而分解。MMP
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1活性借助于为了维持皮肤的稳
态而分泌的TIMP
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1之类的抑制剂而得到调节。MMPs和TIMPs之类的生物分子由包含成纤维细胞在内的细胞而分泌。而且，MMP
‑
1分解细胞外基质，并据此促进肿瘤转移及进展。基于MMP
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1的胶原合成及分解在癌的转移中起到重要作用。因此，将MMP
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1/胶原作为靶的药物和物质作为癌治疗剂或化妆品组合物的目的得到开发。
[0009]并且，已经周知MMP在例如关节炎之类的炎症性疾病或者例如癌转移之类的癌症等病理学条件下过表达，将MMP作为靶的MMP抑制剂被作为如上所述的疾病的治疗剂得到开发。
[0010]如上所述的用于筛选将MMP或胶原作为靶的药物的基于2D细胞的试验，然而基于2D细胞的试验因药物的敏感度、对细胞及组织的药物渗透问题而存在局限性，且不宜用于准确预测存活生命体的反应。而且，由于上述皮肤的结构、功能方面的复杂性，利用一个种类的皮肤细胞的皮肤研究具有限度，为了克服此而开发的三维结构的皮肤模型即为人工皮肤，然而现有的人工皮肤却存在着难以高速筛选药物的局限性。因此，如果想要快速筛选(high
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throughput)药物，则需要开发一种可用于皮肤环境仿真的新型皮肤模型系统。

技术实现思路

[0011]技术问题
[0012]本专利技术之一形态旨在提供一种用于生产成纤维细胞集合体的方法，包括如下的步骤：将成纤维细胞在培养容器中的液体培养基中培养，从而获得包含有因成纤维细胞从表面脱离而形成的成纤维细胞集合体(fibroblast cluster)的培养物，所述培养容器具备涂覆有蛋白质的所述表面，所述蛋白质具有结合于成纤维细胞的活性；以及从所述培养物中分离成纤维细胞集合体，其中，具有结合于所述成纤维细胞的活性的蛋白质以比成纤维细胞与成纤维细胞之间的结合更弱的方式结合于成纤维细胞。
[0013]本专利技术的另一形态旨在提供一种通过上述方法制造的成纤维细胞集合体。
[0014]本专利技术的又一形态旨在提供一种包括由成纤维细胞培养成的成纤维细胞集合体的体外(In vitro)三维皮肤真皮模型，。
[0015]本专利技术的其他形态旨在提供一种用于制造体外三维人工皮肤模型的方法，包括如下步骤：将成纤维细胞在培养容器中的液体培养基中培养，从而获得包含有因成纤维细胞从表面脱离而形成的成纤维细胞集合体(fibroblast cluster)的培养物，其中，所述培养容器具备涂覆有蛋白质的所述表面，所述蛋白质具有与成纤维细胞结合的活性，具有所述成纤维细胞结合的活性的蛋白质以比成纤维细胞与成纤维细胞之间的结合更弱的方式结合于成纤维细胞；以及将源自所述培养物的成纤维细胞集合体额外培养至少12个小时。
[0016]本专利技术的其他形态旨在提供一种用于筛选使MMP的表达或活性减少的物质的方法，包括如下步骤：对所述成纤维细胞集合体或体外三维皮肤真皮模型处理被检测物质；将处理所述被检测物质的成纤维细胞集合体或皮肤真皮模型的MMP的表达或活性的水平进行测量；将测量的MMP的表达或活性的水平与无处理对照组的水平进行比较；以及将使MMP的表达或活性相对于对照组而言降低的物质进行筛选。
[0017]本专利技术的又一不同的形态旨在提供一种用于筛选使胶原的表达或活性增加的物质的方法，包括如下步骤：对所述成纤维细胞集合体或体外三维皮肤真皮模型处理被检测物质；将处理所述被检测物质的成纤维细胞集合体或皮肤真皮模型的胶原的表达或活性的
水平进行测量；将测量的胶原的表达或活性的水平与无处理对照组的水平进行比较；以及将使胶原的表达或活性相对于对照组而言增加的物质进行筛选。
[0018]技术方案
[0019]根据本专利技术之一形态，提供一种用于生产成纤维细胞集合体的方法，包括如下的步骤：将成纤维细胞在培养容器中的液体培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生产成纤维细胞集合体的方法，包括如下的步骤：在具备涂覆有蛋白质的表面的培养容器中的液体培养基中培养成纤维细胞，从而获得包含有因成纤维细胞从所述表面脱离而形成的成纤维细胞集合体的培养物，其中，所述蛋白质具有与成纤维细胞结合的活性；以及从所述培养物中分离成纤维细胞集合体，其中，具有与所述成纤维细胞结合的活性的蛋白质以比成纤...

【专利技术属性】
技术研发人员：金相宪，崔淙勋，朴贵德，
申请(专利权)人：S生物医药公司，
类型：发明
国别省市：