一种屎肠球菌菌剂的制备方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种屎肠球菌菌剂的制备方法及用途，属于微生物领域。其中，所述屎肠球菌的保藏编号为CGMCC No.18047，具有抗逆性强的特点，具备较高的耐酸、耐胆盐、耐高温以及粘附性强等特性，且该菌株具有显著的抑菌性和菌株活力，发酵液活菌数高，能够达到5.0

【技术实现步骤摘要】
一种屎肠球菌菌剂的制备方法及用途
[0001]本申请是以下申请的分案申请：申请日为2019年11月29日，申请号为201911202532.2，专利技术名称为一种屎肠球菌、其菌剂及其菌剂的制备方法与用途。


[0002]本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种屎肠球菌菌剂的制备方法及用途。

技术介绍

[0003]屎肠球菌(Enterococcus faecium)，革兰氏阳性，圆形或卵圆形，单个，成对或短链状排列，无芽孢，无鞭毛。生长温度为30
‑
40℃，适宜pH为5.0
‑
7.5，最适生长温度为35
‑
38℃。屎肠球菌是兼性厌氧的乳酸菌，代谢产生有机酸、过氧化氢、细菌素等物质，这些物质具有抑制病原菌和腐败菌，提高免疫力、改善畜产品品质等生理功效。
[0004]其中代谢产生的细菌素可有效治疗养殖场中常见的顽固疾病，如对葡萄球菌、梭状芽孢杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌有拮抗作用，并且不留有药残。代谢产生大量乳酸，可以显著降低动物肠道pH，保持肠道的酸性环境，抑制病原菌的生长，对致病菌痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、弯曲杆菌、葡萄球菌等致病菌有拮抗作用，过氧化氢能抑制和杀死革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌如假单胞菌属、大肠杆菌类、沙门氏菌属。
[0005]由于乳酸菌的抗逆性差，易失活的特性，必须辅以严格的生产后处理工艺保证其活性，如真空冷冻干燥工艺、微胶囊包被工艺，这就造成了乳酸菌高昂的生产成本。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种屎肠球菌菌剂的制备方法及用途，该屎肠球菌具有抗逆性强，不易失活，具有显著的抑菌性，且具有较高的耐酸、耐胆盐、耐高温以及粘附性强等特性，发酵液活菌数高，能够达到5.0
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CFU/mL以上，在进行喷雾干燥后仍具有显著的菌剂活性，而且，用于制备的微生物饲料添加剂活菌数高，保存期长，大幅度降低了生产成本。发酵液中的酸和细菌素都有很好的抑菌作用，而且该菌株的抗药性强，具有很好的应用前景。本专利技术中的百分号(％)未特殊说明的均为质量百分比。
[0007]为达到此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种屎肠球菌(Enterococcus faecium)，于2019年6月27日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18047，命名为屎肠球菌EF
‑
sj19。
[0009]所述菌株发酵性能显著，菌株活力较高，其生长迟滞期短，接入培养基中即可生长，生长3小时后菌数成倍数增加，即进入对数生长期，生长10小时后菌数几乎不再变化，即进入稳定期，稳定期保持时间长达20小时以上。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供所述屎肠球菌制备获得的屎肠球菌菌剂，具体为菌体干粉。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供所述屎肠球菌菌剂的制备方法，具体如下：
[0012]取活菌浓度为105‑
107CFU/mL的屎肠球菌种子液，按照接种量2
‑
5％接种于发酵培养基中，32
‑
38℃条件下，静置培养20
‑
24小时，得到发酵液；向所述发酵液中加入保护剂，混合，进行喷雾干燥，得到屎肠球菌菌剂。
[0013]优选地，所述屎肠球菌菌剂的制备方法，具体如下：
[0014](1)一级种子液制备；挑取所述屎肠球菌菌落，接入一级种子培养基中，32
‑
38℃条件下静置培养20
‑
24小时，得到一级种子液；
[0015](2)二级种子液制备：将所述一级种子液按照接种量2
‑
4％接入二级种子培养基中，32
‑
38℃条件下静置培养20
‑
24小时，得到二级种子液；
[0016](3)发酵罐发酵：将所述二级种子液按照接种量2
‑
5％接入发酵培养基中，在温度32
‑
38℃，风量0.5
‑
1L/min，转速80
‑
120rpm，发酵过程中维持pH6.0
‑
7.0，控制发酵时间16
‑
20小时；
[0017](4)向所述步骤(3)得到的发酵液中加入保护剂，混合，进行喷雾干燥，得到屎肠球菌菌剂。
[0018]优选地，所述步骤(1)中，一级种子培养基组成为：葡萄糖1
‑
3％，胰蛋白胨0.5
‑
2％，酵母浸粉0.5
‑
2％，乙酸钠0.5
‑
1％，磷酸氢二钾0.1
‑
0.5％，柠檬酸氢二铵0.1
‑
0.5％，硫酸镁0.01
‑
0.05％，硫酸锰0.001
‑
0.005％，吐温80 0.05
‑
0.1mL％，碳酸钙0.05
‑
0.1％，余量为水，pH6.0
‑
7.0。
[0019]优选地，所述步骤(2)中，二级种子培养基组成为：葡萄糖1
‑
2％，糖蜜1
‑
2％，胰蛋白胨0.5
‑
2％，酵母浸粉0.5
‑
2％，乙酸钠0.5
‑
1％，磷酸氢二钾0.1
‑
0.5％，柠檬酸氢二铵0.1
‑
0.5％，硫酸镁0.01
‑
0.05％，硫酸锰0.001
‑
0.005％，吐温80 0.05
‑
0.1mL％，碳酸钙0.05
‑
0.1％，余量为水，pH6.0
‑
7.0。
[0020]优选地，所述步骤(3)中，发酵培养基组成为：葡萄糖1
‑
4％，糖蜜1
‑
4％，胰蛋白胨1
‑
3％，酵母浸粉1
‑
3％，乙酸钠0.5
‑
1％，磷酸氢二钾0.1
‑
0.5％，柠檬酸氢二铵0.1
‑
0.5％，硫酸镁0.01
‑
0.05％，硫酸锰0.001
‑
0.005％，吐温80 0.05
‑
0.1mL％，碳酸钙0.05
‑
0.1％，余量为水，pH6.0
‑
7.0。
[0021]本专利技术的发酵培养基组成相较于MRS肉汤培养基的组成，原料更为廉价，更适用于菌株的工业化生产，而本专利技术菌株可以更好地利用发酵培养基进行发酵增殖。
[0022]优选地，所述步骤(3)中，在发酵过程中，发酵至第5
‑
7h时开始流加补料培养基，补料体积为发酵培养基体积的5
‑
10％，流加速度为35
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种屎肠球菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)的保藏编号为CGMCC No.18047，步骤如下：取菌浓度为105‑
107CFU/ml的屎肠球菌种子液，按照接种量2
‑
5％接种于发酵培养基中，32
‑
38℃条件下，静置培养20
‑
24小时，得到发酵液，向所述发酵液中加入保护剂，混合，进行喷雾干燥，得到屎肠球菌菌剂。2.如权利要求1所述屎肠球菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述保护剂组成为：脱脂奶粉3
‑
5％，大豆油0.5
‑
1％，桃胶0.5
‑
1％，水溶性淀粉5
‑
10％。3.如权利要求1所述屎肠球菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：葡萄糖1
‑
4％，糖蜜1
‑
4％，胰蛋白胨1
‑
3％，酵母浸粉1
‑
3％，乙酸钠0.5
‑
1％，磷酸氢二钾0.1
‑
0.5％，柠檬酸氢二铵0.1
‑
0.5％，硫酸镁0.01
‑
0.05％，硫酸锰0.001
‑
0.005％，吐温80 0.05
‑
0.1％，碳酸钙0.05
‑
0.1％，余量为水，pH6.0
‑
7.0。4.一种屎肠球菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)的保藏编号为CGMCC No.18047，步骤如下：(1)挑取所述屎肠球菌菌落，接入一级种子培养基中，32
‑
38℃条件下静置培养20
‑
24小时，得到一级种子液；(2)将所述一级种子液按照接种量2
‑
4％接入二级种子培养基中，32
‑
38℃条件下静置培养20
‑
24小时，得到二级种子液；(3)将所述二级种子液按照接种量2
‑
5％接入发酵培养基中，于温度32
‑
38℃，风量0.5
‑
1L/min，转速80
‑
120rpm，pH6.0
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7.0，发酵16
‑
20小时；(4)向所述步骤(3)得到的发酵液中加入保护剂，经喷雾干燥，得到屎肠球菌菌剂，其中，喷雾干燥工艺的进风温度为130～160℃，出风温度60～90℃，流速300～400mL/h。5.如权利要求4所述屎肠球菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，一级种子培养基组成为：葡萄糖1
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3％，胰蛋白胨0.5
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2％，酵母浸粉0.5
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【专利技术属性】
技术研发人员：王连民，刘珂飞，
申请(专利权)人：天津市天合力药物研发有限公司，
类型：发明
国别省市：