一种Piezo1基因敲除的肾小球旁细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种Piezo1基因敲除的肾小球旁细胞系及其构建方法。其中，采用靶序列为小鼠第8号染色体第122502249～122502271个碱基的sgRNA；该sgRNA可用于特异性识别Piezo1基因、敲除Piezo1基因、构建Piezo1基因敲除的细胞系、制备用于构建Piezo1基因敲除的细胞系的产品、构建Piezo1基因敲除的动物模型、制备用于构建Piezo1基因敲除的动物模型的产品，尤其在构建Piezo1基因敲除的细胞系时，相对传统文献报道的shRNA干扰方法，该sgRNA可以从基因组层面对靶基因Piezo1表达进行调控，显著提高Piezo1基因的抑制效率。制效率。

【技术实现步骤摘要】
一种Piezo1基因敲除的肾小球旁细胞系及其构建方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种Piezo1基因敲除的肾小球旁细胞系及其构建方法。

技术介绍

[0002]高血压病是最常见的心血管疾病诱因，其发病率和死亡率在全球范围内呈上升的趋势。肾素(Renin)是由肾小球旁器(Juxtaglomerular apparatus)分泌的一种天冬氨酸蛋白酶，主要生理作用是将肾素原分解为血管紧张素Ⅰ，Renin是肾素
‑
血管紧张素(RAAS)轴中的关键限速酶。既往的大量研究证实RAAS系统过度激活与高血压的发生有密切的关系，因此Renin的合成与分泌对机体血压调控有重要作用，是重要的抗高血压药物靶点。
[0003]研究表明球旁细胞合成及分泌Renin的过程是通过入球小动脉血流压力调控。血压下降触发肾素的分泌，进一步导致血管紧张素Ⅱ引起的血压升高，反之，血压升高会抑制肾素的分泌。传入小动脉血压与肾素分泌之间的反向关系构成一个负反馈，调控机体血压的稳定。然而到目前为止，肾小球旁细胞如何感受血流压力以及其具体的作用机制依然不清楚。Piezo1作为一种新型的机械敏感性离子通道蛋白，在细胞感受机械应力过程中发挥重要作用。研究Piezo1在球旁细胞中的表达及调控Renin合成作用及相关机制进行研究，对调控球旁细胞Renin合成有重要的意义，为高血压疾病治疗及抗高血压药物开发提供新的策略。为达到此目的，首先考虑是建立一株稳定干扰Piezo1表达的细胞株，这样才能更好的对其下游表达及功能进行研究。目前用于体外实验针对Piezo1功能的方法，例如干预其基因表达，多采用小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)、短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)，或者采用Piezo1抑制剂的方法。
[0004]siRNA是一种长度约20～25个核苷酸的双链RNA，其干扰靶基因表达需要Dicer酶和RNA诱导的沉默复合体(RNA
‑
induced silencing complex,RISC)等参与。shRNA包括两个短反向重复序列，将其克隆到shRNA表达载体中，通过与miRNA的加工相同的RNAi机制，shRNA被加工成siRNA。使用细菌或病毒载体，shRNA可以被导入靶细胞的细胞核内，shRNA通过细胞内一系列加工形成在两个3
’
末端带有两个游离碱基的20
‑
25nt的双链siRNA。这一有活性的siRNA随后被整合到RISC上，从而发挥干扰作用。但siRNA以及shRNA干扰技术对基因表达的调控是在转录层面实现，其主要缺点是干扰效率低，干扰持续时间有限，干扰效果不稳定等。
[0005]此外，Piezo1的抑制剂也是干扰其功能的途径之一。目前常用的Piezo1抑制剂有Dooku1，钌红(Ruthenium Red,RR),GsMTx4，Gd
3+
等。其中Dooku1是目前发现的唯一具有选择性的Piezo通道抑制剂，除此之外其余抑制剂都会对除Piezo外的其他离子通道产生影响。如RR同时对TRPV和Piezo通道有抑制作用，GsMTx4对Piezo和TRPC类型的离子通道同时有抑制作用，而Gd
3+
则是一种非选择性的钙离子通道抑制剂。因此，使用抑制剂进行Piezo1的干扰实验显然具有不可避免的缺陷，从而限制了其使用。

技术实现思路

[0006]本专利技术第一方面的目的，在于提供一种sgRNA。
[0007]本专利技术第二方面的目的，在于提供编码本专利技术第一方面的sgRNA的核酸分子。
[0008]本专利技术第三方面的目的，在于提供包含本专利技术第二方面的核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞系。
[0009]本专利技术第四方面的目的，在于提供一种CRISPR/Cas9系统。
[0010]本专利技术第五方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的sgRNA的应用。
[0011]本专利技术第六方面的目的，在于提供本专利技术第二方面的核酸分子的应用。
[0012]本专利技术第七方面的目的，在于提供本专利技术第三方面的表达盒、重组载体或转基因细胞系的应用。
[0013]本专利技术第八方面的目的，在于提供本专利技术第四方面的CRISPR/Cas9系统的应用。
[0014]本专利技术第九方面的目的，在于提供一种Piezo1基因敲除的细胞系的构建方法。
[0015]本专利技术第十方面的目的，在于提供一种Piezo1基因敲除的细胞系。
[0016]本专利技术第十一方面的目的，在于提供本专利技术第十方面的细胞系在药物筛选中的应用。
[0017]本专利技术第十二方面的目的，在于提供本专利技术第十方面的细胞系在制备药物筛选试剂盒中的应用。
[0018]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0019]本专利技术的第一个方面，提供一种sgRNA，所述sgRNA的靶序列为小鼠第8号染色体第122502249～122502271个碱基。
[0020]优选地，所述sgRNA的序列为：5
’‑
TAGATGCTGCCCCAGCCGTG
‑3’
。
[0021]本专利技术的第二个方面，提供编码本专利技术第一方面的sgRNA的核酸分子。
[0022]本专利技术的第三个方面，提供包含本专利技术第二方面的核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。
[0023]所述表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述sgRNA的DNA，该DNA不但可包括启动所述sgRNA的编码基因转录的启动子，还可包括终止编码基因转录的终止子。
[0024]优选地，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0025]优选地，所述转基因细胞不包括繁殖材料。
[0026]本专利技术的第四个方面，提供一种CRISPR/Cas9系统，包含本专利技术第一方面的sgRNA。
[0027]优选地，所述CRISPR/Cas9系统还包含Cas9。
[0028]本专利技术的第五个方面，提供第一方面的sgRNA在(1)～(6)中任一项中的应用；
[0029](1)特异性识别Piezo1基因；
[0030](2)敲除Piezo1基因；
[0031](3)构建Piezo1基因敲除的细胞系；
[0032](4)制备用于构建Piezo1基因敲除的细胞系的产品；
[0033](5)构建Piezo1基因敲除的动物模型；
[0034](6)制备用于构建Piezo1基因敲除的动物模型的产品。
[0035]优选地，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
[0036]优选地，所述细胞系不包括繁殖材料。
[0037]本专利技术的第六个方面，提供第二方面的核酸分子在(1)～(6)中任一项中的应用；
[0038](1)特异性识别Piezo1基因；
[0039](2)敲除Piezo1基因；
[0040](3)构建Pie本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种sgRNA，所述sgRNA的靶序列为小鼠第8号染色体第122502249～122502271个碱基。2.根据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA的序列为：5
’‑
TAGATGCTGCCCCAGCCGTG
‑3’
。3.编码权利要求1或2所述的sgRNA的核酸分子。4.包含权利要求3所述的核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。5.一种CRISPR/Cas9系统，包含权利要求1或2所述的sgRNA；优选地，所述CRISPR/Cas9系统还包含Cas9。6.(a)～(d)中任一项在(1)～(6)中任一项中的应用：(a)权利要求1或2所述的sgRNA；(b)权利要求3所述的核酸分子；(c)权利要求4所述的表达盒、重组载体或转基因细...

【专利技术属性】
技术研发人员：周一鸣，杨小强，汪乐，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：