一种快速定量检测水环境中大肠杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速定量检测水环境中大肠杆菌的方法，属于微生物检测技术领域。通过本申请的检测技术和数据分析方法可以对水环境中的大肠杆菌进行快速定量，本方法操作简单，可在5分钟内实现水中大肠杆菌的快速定量，检测结果与平板计数法相比误差可低于20％，且电极体系经过简单处理可以实现重复使用，不需要降噪、电极预修饰和细菌预标记等复杂处理。电极预修饰和细菌预标记等复杂处理。电极预修饰和细菌预标记等复杂处理。

【技术实现步骤摘要】
一种快速定量检测水环境中大肠杆菌的方法


[0001]本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种快速定量检测水环境中大肠杆菌的技术方法。

技术介绍

[0002]食源性病原体引起了全世界的关注，因为它们是食源性和水源性疾病的主要来源。致病菌株也是环境生物学、医院、供水系统和食品工业的主要关注点，因为微生物感染可以导致多种疾病，甚至其中一些可能导致死亡。更重要的是，越来越多的水源受到致病菌株的污染，如沙门氏菌、葡萄球菌和大肠杆菌，可导致伤寒、胃肠炎、霍乱和腹泻等反应。其中，大肠杆菌是在自然界广泛传播的最重要的病原菌之一。大肠杆菌是一种革兰氏阴性的非孢子形的杆菌，本质上是兼性厌氧的。据调查，一些家庭使用纯水机、桶装水、矿泉水，由于其暴露时间长，导致二次污染，仍有25％的水样细菌总数或大肠菌群超标。由于各种大肠杆菌的致病性及其在饮用水、食品、河流甚至工业水中的广泛分布，对这些大肠杆菌进行检测和定量已成为当务之急。
[0003]根据世界卫生组织的调查，造成人类常见疾病的根本原因是缺乏安全饮用水和食物。因此，开发准确、快速的检测技术对于监测这两种重要资源，进一步保障人类健康具有重要意义。目前，基于培养和分子的传统方法检测和计数大肠杆菌仍然是最常用的技术。传统的大肠杆菌检测方法存在操作复杂、检测时间长(一般需要1
‑
2天才能得到结果)、难以满足污染源快速诊断的需要等缺点。近年来，许多基于不同检测原理的方法得到了很大的发展，如聚合酶链式反应(PCR)，免疫检测，ATP生物发光，流式细胞术等。与传统的培养方法相比，这些方法具有一定的优势，但检测时间仍然很长。基于生物传感器的方法在过去15年中已经建立并得到快速发展，以加快检测速度和提高检测灵敏度。电化学生物传感器被认为是检测食源性致病菌最有前途的方向之一，且越来越多的研究聚焦于此。电化学生物传感器具有灵敏度高、响应速度快、可在混浊溶液中工作以及小型化等优点。另一方面，直接使用电化学生物传感器检测未经处理的样品中的病原菌很困难。此外，被测物体的复杂程度会因黏度和不溶物含量的不同而有所不同，这对生物传感器的性能有很大的影响。目前，电化学生物传感器集中于研究对传感器的功能化修饰，修饰制备过程繁琐复杂。
[0004]因此，如何利用简单易得的未修饰电极对细菌进行定量分析，以供快速检测用，是本领域人员待解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术公开了一种快速定量检测水环境中大肠杆菌的技术方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种快速定量检测水环境中大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
[0008](1)电化学检测体系包括：电化学工作站、电解池、工作电极、辅助电极和参比电极；
[0009]所述工作电极为玻碳电极；
[0010]所述辅助电极为铂丝电极；
[0011]所述参比电极为银/氯化银电极；
[0012](2)待测水样与浓度为20mM K4Fe(CN)6溶液按照体积比为1:5混合；
[0013](3)将(2)中的混合液作为电解液置于电解池中，放入工作电极、辅助电极和参比电极，连接电化学工作站后，利用计时电流法进行检测；
[0014](4)将(3)中得到数据进行处理，计算得到待测水样中大肠杆菌浓度。
[0015]作为优选的技术方案，步骤(1)中，所述玻碳电极的处理步骤：
[0016](1)依次用粒径1.0μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末抛光玻碳电极，得抛光玻碳电极；
[0017](2)抛光玻碳电极依次在HNO3、NaOH、丙酮、乙醇和超纯水中超声清洗5分钟，得清洗抛光玻碳电极；
[0018](3)得清洗抛光玻碳电极在0.5M的硫酸溶液中，在如下参数：扫描电压范围
‑
1～1V、扫描速度500mV/s，进行100个循环的循环伏安活化；
[0019](4)将活化后的清洗抛光玻碳电极置于含有0.2M KNO3和1mM K3Fe(CN)6的溶液中测定氧化还原峰差值，使氧化还原峰差值ΔEp<80mV。
[0020]一种快速定量检测水环境中大肠杆菌的检测方法，计时电流法的参数设置：
[0021](1)阶跃电压为0.6V(相对参比电极电位)；
[0022](2)检测时间设定为200s；
[0023](3)电流数据采样间隔设定为0.1s。
[0024]一种快速定量检测水环境中大肠杆菌的方法，数据分析方法1步骤如下：
[0025](1)将权利要求1步骤(3)中得到的电流
‑
时间(i
‑
t)曲线利用公式1进行拟合，解析出参数i0；
[0026](2)将i0带入公式2，解析出参数C，即为所测样品中大肠杆菌的浓度。
[0027]所述公式1：其中i为电流值，t为时间，i0、A和τ为需要解析的参数
[0028]所述公式2：|i0|＝
‑
5.907
×
10
‑7×
lgC+2.908
×
10
‑5，其中i0为公式1中的i0，C为待测水溶液中大肠杆菌的浓度，单位为cfu/mL。
[0029]一种快速定量检测水环境中大肠杆菌技术方法，数据分析方法2步骤如下：
[0030](1)将权利要求1步骤(3)中得到的电流
‑
时间(i
‑
t)曲线进行积分得到电量
‑
时间(Q
‑
t)曲线；
[0031](2)利用公式3对Q
‑
t曲线进行拟合，解析出参数A；
[0032](3)将A带入公式4，解析出参数C，即为所测样品中大肠杆菌的浓度。
[0033]所述公式3：其中Q为电量，t为时间，A和B为需要解析的参数；
[0034]所述公式4：|A|＝
‑
9.330
×
10
‑7×
lgC+5.942
×
10
‑5，其中A为公式3中的A；C为所测样品中大肠杆菌的浓度，单位为cfu/mL。
[0035]综上所述，本专利技术公开了一种快速定量检测水环境中大肠杆菌技术方法。通过本
申请的检测技术和数据分析方法可以对水环境中的大肠杆菌进行快速定量，本方法操作简单，可在1分钟内实现水中大肠杆菌的快速定量，检测结果与平板计数法相比误差可低于20％，且电极体系经过简单处理可以实现重复使用，不需要降噪、电极预修饰和细菌预标记等复杂处理。
附图说明
[0036]图1为电化学三电极体系组成示意图；
[0037]图2为处理后的玻碳电极表面照片；
[0038]图3为检测大肠杆菌菌液后玻碳电极表面照片，其中(A)为吸附的细菌，(B)为细菌成分能谱分析；
[0039]图4为检测大肠杆菌菌液后玻碳电极表面经PI染色的照片，其中(A)为检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速定量检测水环境中大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)电化学检测体系包括：电化学工作站、电解池、工作电极、辅助电极和参比电极；所述工作电极为玻碳电极；所述辅助电极为铂丝电极；所述参比电极为银/氯化银电极；(2)待测水样与浓度为20mM K4Fe(CN)6溶液按照体积比为1:5混合；(3)将(2)中的混合液作为电解液置于电解池中，放入工作电极、辅助电极和参比电极，连接电化学工作站后，利用计时电流法进行检测；(4)将(3)中得到数据进行处理，计算得到待测水样中大肠杆菌浓度。2.如权利要求1所述的一种快速定量检测水环境中大肠杆菌的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述玻碳电极的处理步骤：(1)依次用粒径1.0μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末抛光玻碳电极，得抛光玻碳电极；(2)抛光玻碳电极依次在HNO3、NaOH、丙酮、乙醇和超纯水中超声清洗5分钟，得清洗抛光玻碳电极；(3)得清洗抛光玻碳电极在0.5M的硫酸溶液中，在如下参数：扫描电压范围
‑
1～1V、扫描速度500mV/s，进行100个循环的循环伏安活化；(4)将活化后的清洗抛光玻碳电极置于含有0.2M KNO3和1mM K3Fe(CN)6的溶液中测定氧化还原峰差值，使氧化还原峰差值ΔEp<80mV。3.一种快速定量检测水环境中大肠杆菌的检测方法，其特征在于，计时电流法的参数设置：(1)阶跃电压为0.6V(相对参比电极电位)；(2)检测时间设定为200s；(3)电流数据采样间隔设定为0.1s。4.一种快速定量检测水环境中大肠杆菌的方法，其特征在于，数...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱志刚，王景峰，李辰宇，曹卓松，谌志强，杨晓波，王尚，薛斌，赵辰，张曦，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：