假重组嵌合黄瓜花叶病毒介导的基因沉默系统及其应用技术方案

本发明专利技术提出了一种黄瓜花叶病毒介导的基因沉默系统及其在植物目的基因沉默中的应用。本发明专利技术的基因沉默系统是通过改造一种假重组嵌合体黄瓜花叶病毒侵染性克隆所获得，这种侵染性克隆可高效侵染植物且又不产生严重的病症。本发明专利技术的基因沉默系统具有多种优势，可高效沉默目的基因，基因沉默持续时间长，有助于大规模进行植物基因功能组学研究，操作方法简单且不依赖于专门的设备，具有重大的应用前景。景。

【技术实现步骤摘要】
假重组嵌合黄瓜花叶病毒介导的基因沉默系统及其应用


[0001]本专利技术涉及生物领域。具体地，本专利技术涉及假重组嵌合黄瓜花叶病毒沉默载体的构建及其在植物目的基因沉默中的应用。

技术介绍

[0002]病毒诱导的基因沉默(virus
‑
induced gene silencing，VIGS)是一种基于植物体内RNA 介导的抗病毒防御机制发展起来的技术，已被广泛应用于植物基因功能的研究以及功能基因的筛选鉴定中。通过将植物基因序列插入到病毒中，随着病毒在植物体内的复制和运动，实现植物内源基因RNA的特异性降解。与其它诱导基因缺失的方法相比，VIGS具有以下优点：简单、快速、高效地引起基因沉默；不需要稳定的植物转化过程；VIGS可应用于正向和反向遗传学研究，从而架起基因型和表型之间的桥梁；VIGS可实现同时沉默多个不同基因或同一基因家族的多个成员；VIGS可对不同物种或单一物种不同背景下的基因功能进行快速有效的差异性分析。因此，VIGS技术在植物功能基因组学研究中具有良好的应用前景。
[0003]玉米是一种重要的经济作物和模式植物，目前已获得多个玉米株系的全基因组序列，但由于目前研究技术手段的局限，对其基因功能的研究及开发相对滞后，因而对有效技术和工具(例如VIGS)的开发和应用有迫切的需求。目前，已报道的可应用于玉米的VIGS 载体共有6个：1)雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus，BMV)介导的VIGS载体最早应用于玉米中进行目的基因的沉默，由于该病毒在植株体内会引起明显的病症以及插入片段易丢失的特点，限制了BVM
‑
VIGS载体的广泛应用；2)黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus， CMV)介导的VIGS载体以一种天然侵染玉米的CMV分离物CMV
‑
ZMBJ为材料进行改造，通过针刺玉米种子的方法将VIGS载体导入种胚内，进而实现多个玉米基因的沉默。该VIGS 载体依赖于低温才可获得较好的沉默效果，但在该环境条件下不利于玉米的生长发育；3) 通过基因枪技术可将狗尾草花叶病毒(Foxtail mosaic virus，FoMV)介导的VIGS载体导入玉米叶片细胞内，实现内源基因的沉默，但该技术造价昂贵且依赖于专门的设备，不利于广泛的推广和使用；4)大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)介导的VIGS 载体在大麦、小麦和水稻等中具有良好的应用，但该VIGS载体在玉米应用中具有侵染率低且基因沉默效果差的缺点；5)烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)介导的VIGS 载体采用一种新型的病毒接种手段，通过真空辅助农杆菌渗入及共培养的方法，可沉默小麦和玉米内源基因，但该方法的有效性还需要进一步的研究进行验证；6)玉米雷亚多非纳病毒(Maize rayado fino virus，MRFV)介导的VIGS载体可在玉米整个生长周期内实现基因沉默，但与其他借助针刺接种方法的VIGS载体类似，其在玉米上的侵染率不甚理想。鉴于目前的VIGS载体在玉米研究中应用的局限性，开发一种新的稳定、高效且易于操作的VIGS载体具有重要的意义。
[0004]CMV以其宿主范围广而著名，可侵染100多个家族1200种以上的单子叶和双子叶植物。CMV基因组含有3条正义单链RNA分子，编码5个蛋白，RNA1编码复制酶1a，RNA2 编码复制
酶2a和RNA沉默抑制子2b，RNA3编码运动蛋白MP(movement protein)和外壳蛋白CP(coat protein)。不同的CMV株系，在生物学和分子特性上具有差异，通过假重组和/或构建嵌合体病毒，可改变病毒本身的特性，产生具有不同侵染力和宿主侵染范围的新病毒。在过去的100年，从各种宿主植物中分离到了大量的CMV株系，为病毒假重组和/或构建嵌合体病毒提供了大量的资源，目前尚未有在玉米上应用的基于假重组联合嵌合体的CMV病毒开发的VIGS载体。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本专利技术提出了一种黄瓜花叶病毒侵染性克隆、病毒介导的基因沉默系统、宿主菌组合物、试剂盒及其应用和沉默植物中目的基因的方法，黄瓜花叶病毒介导的基因沉默系统基于一种侵染性克隆改造而来，该侵染性克隆是通过体外假重组和构建嵌合体的方式所获得，可高效侵染植物但又不产生严重的病症，适用于VIGS载体的开发。本专利技术提出的黄瓜花叶病毒介导的基因沉默系统，可实现目的基因的高效沉默，且基因沉默持续时间长，有助于大规模进行植物基因功能组学研究，具有重大的应用前景。
[0006]在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种黄瓜花叶病毒侵染性克隆。根据本专利技术的实施例，所述黄瓜花叶病毒侵染性克隆包括：pCMVF1载体、pCMVZ2载体和pCMVFZ3载体。本专利技术通过体外假重组和构建嵌合病毒RNA载体，获得了一种Pr CMV侵染性克隆，其可高效侵染植物，实现目的基因的沉默，且基因沉默持续时间长，但又不产生严重的病症，适用于VIGS载体的开发，有助于大规模进行植物基因功能组学研究，具有重大的应用前景。
[0007]根据本专利技术的实施例，上述黄瓜花叶病毒侵染性克隆还可以具有下列附加技术特征：
[0008]根据本专利技术的实施例，所述pCMVF1载体、pCMVZ2载体和pCMVFZ3载体中的病毒序列来源于不同的黄瓜花叶病毒株系，所述黄瓜花叶病毒侵染性克隆是通过假重组和构建嵌合体的方式所获得。
[0009]根据本专利技术的实施例，所述pCMVFZ3载体是通过将pCMVF3载体中的至少部分序列和pCMVZ3载体中的至少部分序列进行嵌合所获得的。
[0010]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种病毒介导的基因沉默系统。根据本专利技术的实施例，所述病毒介导的基因沉默系统包括：pCMVZ2
2bN81
载体或pCMVZ2
2bN81
‑
LIC载体、 pCMVF1载体和pCMVFZ3载体；其中，所述pCMVZ2
2bN81
载体和pCMVZ2
2bN81
‑
LIC载体是通过将前面所述黄瓜花叶病毒侵染性克隆中的pCMVZ2载体进行改造而获得的。通过将黄瓜花叶病毒侵染性克隆中的pCMVZ2载体进行改造，获得两套VIGS载体系统Pr CMVVIGS和Pr CMV
‑
LIC VIGS，在这两套VIGS载体系统中外源基因可被插入到pCMVZ2
2bN81
载体或pCMVZ2
2bN81
‑
LIC载体上，实现目的基因的沉默，且基因沉默持续时间长，但又不产生严重的病症。
[0011]根据本专利技术的实施例，所述基因沉默系统进一步包括外源基因，所述外源基因通过酶切连接的方法插入到pCMVZ2
2bN81
载体中，或通过不依赖于连接反应的克隆方法插入到 pCMVZ2
2bN81
‑
LIC载本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黄瓜花叶病毒侵染性克隆，其特征在于，包括：pCMVF1载体、pCMVZ2载体和pCMVFZ3载体。2.根据权利要求1所述的黄瓜花叶病毒侵染性克隆，其特征在于，所述pCMVF1载体、pCMVZ2载体和pCMVFZ3载体中的病毒序列来源于不同的黄瓜花叶病毒株系，任选地，所述黄瓜花叶病毒侵染性克隆是通过假重组和构建嵌合体的方式所获得；任选地，所述pCMVFZ3载体是通过将pCMVF3载体中的至少部分序列和pCMVZ3载体中的至少部分序列进行嵌合所获得的。3.一种病毒介导的基因沉默系统，其特征在于，包括：pCMVZ2
2bN81
载体或pCMVZ2
2bN81
‑
LIC载体、pCMVF1载体和pCMVFZ3载体；其中，所述pCMVZ2
2bN81
载体和pCMVZ2
2bN81
‑
LIC载体是通过将权利要求1～3任一项所述黄瓜花叶病毒侵染性克隆中的pCMVZ2载体进行改造而获得的。4.根据权利要求3所述的病毒介导的基因沉默系统，其特征在于，进一步包括外源基因，所述外源基因通过酶切连接的方法插入到pCMVZ2
2bN81
载体中，或通过不依赖于连接反应的克隆方法插入到pCMVZ2
2bN81
‑
LIC载体中。5.一种宿主菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉乐，李焕改，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：