一种检测耐甲基西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法技术

本发明专利技术提供一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法。采用双标记和等温循环链置换聚合反应(ISDPR)扩增技术，得到高灵敏、高选择性的mecA基因电化学生物传感器：通过在金电极上逐步修饰纳米金、5

【技术实现步骤摘要】
一种检测耐甲基西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法


[0001]本专利技术属于电化学分析检测
，具体涉及一种修饰纳米金和捕获DNA的金电极作为工作电极，采用双标记和等温循环链置换聚合反应用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法。

技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌是一种主要的人类病原体，它具有一系列的病毒因子，并能对大多数抗生素产生耐药性。这种能力进一步增强，不断出现新的克隆，使金黄色葡萄球菌成为超级细菌。临床使用甲氧西林导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现。
[0003]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在医院和社区环境中普遍存在，是世界范围内的一种主要细菌病原体。MRSA可导致人体不同部位的感染，从皮肤和蜂窝组织炎到侵入性菌血症、心内膜炎和医疗器械相关感染。这些疾病可能是致命的，特别是在免疫功能低下的人。因为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌抵抗所有β
‑
内酰胺抗生素,如青霉素、甲氧西林和阿莫西林而受到广泛关注。
[0004]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对β
‑
内酰胺类抗生素的耐药性是由一个可移动的遗传元件介导的，即mecA基因。mecA基因可编码生成青霉素结合蛋白PBP2a，该蛋白与β
‑
内酰胺类抗生素亲和力明显降低，并对青霉素、半合成青霉素和除头孢他林和头孢双胎外的头孢菌素产生耐药性。因此，mecA基因可作为MRSA检测的指标。
[0005]现有技术中，针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对β
‑r/>内酰胺类抗生素的耐药性，主要分为常规表型检测(药敏试验)和耐药基因检测。
[0006]常规药敏试验在国内实验室常规检测中比较常用，但需要至少2
‑
3天的培养时间，而且许多生长缓慢和不易培养的细菌，无法通过常规药敏试验检测其耐药性。以DNA探针和聚合酶链式反应为基础的实时荧光定量聚合酶链式反应技术可以从分子生物学水平检测细菌耐药，但是受到一些缺陷的限制，比如需要专业的操作人员、价格昂贵和操作复杂等。因此，开发一种敏感、快速和方便的MRSA 检测新方法很重要。目前已经报道了许多基于mecA基因杂交的光学、电化学和压电等方法来实现对MRSA的检测。这些传感装置中，电化学生物传感法由于具有操作方便、灵敏度高、响应速度快、便携等优点被广泛使用。目前已经研究出的mecA基因的电化学生物传感器虽可以快速检测mecA基因，但是选择性不强，灵敏度不高。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对上述缺陷，提供一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法。为实现上述目的，我们将多重修饰的金电极作为工作电极接入三电极体系，提供了一种检测耐甲基西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法。
[0008]本专利技术提供如下技术方案：一种检测耐甲基西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法，包括以下步骤：
[0009]1)采用氧化铝粉末打磨3mm直径的柱状金电极直至所述金电极表面滑成镜面，接着把打磨好的金电极用超纯水和无水乙醇超声清洗干净；然后，用新鲜配置的活化溶液活化金电极表面，超纯水清洗后用循环伏安法以
‑
0.3V～1.5V的电压在0.5M的硫酸溶液中反复扫描，直到稳定重复的CV曲线出现，用超纯水清洗干净后烘干待用；
[0010]2)将所述步骤1)预处理后的所述金电极用循环伏安法在0.5mM HAuCl4溶液中扫描50圈，用超纯水清洗干净后烘干待用；
[0011]3)在所述步骤2)的得到的修饰好纳米金的金电极上滴加10μM二茂铁(Fc)修饰的捕获DNA，避光过夜孵育；
[0012]4)将所述步骤3)得到的金电极浸泡于1mM 6
‑
巯基
‑1‑
乙醇与10mM Tris
‑
HCl缓冲液中37℃反应2h，再用超纯水反复清洗去除未结合的6
‑
巯基
‑1‑
乙醇，得到用6
‑
巯基
‑1‑
乙醇封闭好的金电极；
[0013]5)向所述步骤4)得到的金电极滴加50μL含有不同浓度的mecA基因、5mL亚甲基蓝(MB)修饰的引物、5U聚合酶和dNTPs的聚合酶缓冲液，37℃混合孵育2h；
[0014]6)将所述步骤5)得到的电极作为工作电极，并采用Ag/AgCl作为参比电极、铂丝电极作为对电极，同时置于20mM Tris
‑
HCl中，采用试差脉冲伏安法，的电压范围内进行检测，得到二茂铁(Fc)和亚甲基蓝(MB)的特征响应电流值，亚甲基蓝(MB)的响应电流值与二茂铁(Fc)的响应电流值比值的对数与mecA基因浓度的对数具有良好的线性关系，在相同的测试条件下，依次记录不同浓度的mecA基因对应的两组特征响应电流值，计算亚甲基蓝(MB)的响应电流值与二茂铁(Fc)的响应电流值的比值并绘制成标准曲线，通过拟合曲线得到相应的线性回归方程；
[0015]7)向所述步骤1)
‑
4)制备得到的金电极分别滴加50μL含有200pM的mecA基因、5mL MB修饰的引物、5U聚合酶和dNTPs的聚合酶缓冲液，以及3种含有200pM的错配基因、5mL MB修饰的引物、5U聚合酶和dNTPs的50μL聚合酶缓冲液和50μL含有不添加基因的5mL MB修饰的引物、5U聚合酶和dNTPs的聚合酶缓冲液作为空白对照组，上述五组混合溶液均在37℃混合孵育2h；采用与所述步骤5)同样的工作电极、参比电极和对电极以及试差脉冲伏安法的Tris
‑
HCl溶液和检测电压范围，进行检测，得到二茂铁(Fc)和亚甲基蓝(MB)的特征响应电流值。
[0016]进一步地，所述步骤1)中的所述活化溶液为按照体积比为3:1配置的浓硫酸和过氧化氢混合溶液，所述活化溶液配置所采用的浓硫酸的质量分数为98％，采用的过氧化氢的质量分数为30％。
[0017]进一步地，所述步骤2)中采用的循环伏安法扫描电压为
‑
0.4V～0.3V。
[0018]进一步地，所述步骤4)和所述步骤6)采用的Tris
‑
HCl缓冲液的pH为7.4。
[0019]进一步地，所述步骤4)和所述步骤6)采用的Tris
‑
HCl缓冲液中含有140mM氯化钠和5mM氯化镁。
[0020]进一步地，所述步骤5)中所采用的不同浓度的mecA基因溶液的浓度如下：1.0
×
10
‑
14
mol/L，2.0
×
10
‑
14
mol/L，5.0
×
10
‑
14
mol/L，1.0
×
10
‑
13
mol/L，3.0
×
10
‑
13
mol/L，5.0
×
10...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测耐甲基西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采用氧化铝粉末打磨3mm直径的柱状金电极直至所述金电极表面滑成镜面，接着把打磨好的金电极用超纯水和无水乙醇超声清洗干净；然后，用新鲜配置的活化溶液活化金电极表面，超纯水清洗后用循环伏安法以
‑
0.3V～1.5V的电压在0.5M的硫酸溶液中反复扫描，直到稳定重复的CV曲线出现，用超纯水清洗干净后烘干待用；2)将所述步骤1)预处理后的所述金电极用循环伏安法在0.5mM HAuCl4溶液中扫描50圈，用超纯水清洗干净后烘干待用；3)在所述步骤2)的得到的修饰好纳米金的金电极上滴加10μM二茂铁修饰的捕获DNA，避光过夜孵育；4)将所述步骤3)得到的金电极浸泡于1mM 6
‑
巯基
‑1‑
乙醇与10mM Tris
‑
HCl缓冲液中37℃反应2h，再用超纯水反复清洗去除未结合的6
‑
巯基
‑1‑
乙醇，得到用6
‑
巯基
‑1‑
乙醇封闭好的金电极；5)向所述步骤4)得到的金电极滴加50μL含有不同浓度的mecA基因、5mL亚甲基蓝修饰的引物、5U聚合酶和dNTPs的聚合酶缓冲液，37℃混合孵育2h；6)将所述步骤5)得到的电极作为工作电极，并采用Ag/AgCl作为参比电极、铂丝电极作为对电极，同时置于20mM Tris
‑
HCl中，采用试差脉冲伏安法，的电压范围内进行检测，得到二茂铁和亚甲基蓝的特征响应电流值，亚甲基蓝的响应电流值与二茂铁的响应电流值比值的对数与mecA基因浓度的对数具有良好的线性关系，在相同的测试条件下，依次记录不同浓度的mecA基因对应的两组特征响应电流值，计算亚甲基蓝的响应电流值与二茂铁的响应电流值的比值并绘制成标准曲线，通过拟合曲线得到相应的线性回归方程；7)向所述步骤1)
‑
4)制备得到的金电极分别滴加50μL含有200pM的mecA基因、5mL MB修饰的引物、5U聚合酶和dNTPs的聚合酶缓冲液，以及3种含有200pM的错配基因、5mL MB修饰的引物、5U聚合酶和dNTPs的50μL聚合酶缓冲液和50μL含有不添加基因的5mL MB修饰的引物、5U聚合酶和dNTPs的聚合酶缓冲液作为空白对照组，上述五组混合溶液均在37℃混合孵育2h；采用与所述步骤5)同样的工作电极、参比电极和对电极以及试差脉冲伏安法的Tris
‑
HCl溶液和检测电压范围，进行检测，得到二茂铁和亚甲基蓝的特征响应电流值。2.根据权利要求1所述的一种检测耐甲基西林金黄色葡萄球菌mecA基因的电化学方法，其特征在于，所述步骤1)中的所述活化溶液为按照体积比为3:1配置的浓硫酸和过氧化氢混合溶液，所述活化溶液配置所采用的浓硫酸的质量分数为98％，采用的过氧化氢的质量分数为30％。3.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：王颖，翟咏昕，李风亭，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：