本发明专利技术公开了一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述检测试剂盒用于检测昂司丹琼代谢标志物ABCB1C3435T和ABCB1G2677T/A两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：ABCB1C3435T扩增引物、ABCB1C3435T测序引物、ABCB1G2677T/A扩增引物、ABCB1G2677T/A测序引物和阳性对照。本发明专利技术以多重RPA扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对昂丹司琼用药相关的基因多态性进行检测，试剂盒可同时检测ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677T/A)基因多态性，为临床个性化用药给出基因角度的建议。基因角度的建议。基因角度的建议。
【技术实现步骤摘要】
一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用
[0001]本专利技术涉及一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。
技术介绍
[0002]昂丹司琼为一种高度选择性的5
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羟色胺(5
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HT3)受体拮抗剂，能抑制由化疗和放疗引起的恶心呕吐，有高强度和高度的选择性，能控制小肠及CTZ中受体受刺激而引起的呕吐。适用于治疗由化疗和放疗引起的恶心呕吐，也可用于预防和治疗手术后引起的恶心呕吐。然而，但仍有35％的患者抱怨仍有呕吐，这意味着不同患者对药物的反应不同。
[0003]到目前为止，止吐药反应差异的原因尚不清楚。除了归因于这种恶心和呕吐的许多危险因素外，现在已经意识到遗传因素可能是造成这种变异的原因。昂丹司琼被血脑屏障中的腺苷5'
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三磷酸结合盒B族亚家族B成员1(ABCB1)药物转运蛋白识别，后者又决定了中枢神经系统(CNS)中的药物浓度。
[0004]目前，对于基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的方法。
技术实现思路
[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是获得一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用。
[0006]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒的技术方案如下：
[0007]本专利技术的试剂盒针对ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677T/A)两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、ABCB1(C3435T)测序引物、ABCB1(G2677T/A)测序引物、阳性对照。
[0008]优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：
[0009][0010]优选的，所述ABCB1(C3435T)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示；所述ABCB1(G2677T/A)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示。更优选的，所述的扩增引物为生物素标记引物。
[0011]优选的，所述的ABCB1(C3435T)测序引物、ABCB1(G2677T/A)测序引物分别如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。
[0012]优选的，所述的试剂1包括：扩增缓冲液，18mM醋酸镁；
[0013]优选的，所述的试剂2包括：ABCB1(C3435T)后引物，ABCB1(C3435T)后引物，ABCB1(G2677T/A)前引物，ABCB1(G2677T/A)后引物，dNTPS、链置换DNA聚合酶，单链DNA结合蛋白，结合单链核酸的重组酶，海藻糖；可在恒温条件下进行ABCB1(C3435T)/ABCB1(G2677T/A)同时扩增。
[0014]更优选的，试剂2各组分浓度分别为：ABCB1(C3435T)后引物(0.32uM)，ABCB1(C3435T)后引物(0.32uM)，ABCB1(G2677T/A)前引物(0.32uM)，ABCB1(G2677T/A)后引物(0.32uM)，dNTPS(0.3mM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)，海藻糖(0.2％)；
[0015]优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677A)杂合型基因组DNA。阳性对照对应所检测基因位点的杂合型，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
[0016]本专利技术还公开了一种采用上述试剂盒的昂丹司琼用药相关的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0017]a.将所述扩增反应液与5ul待测基因组DNA，采用多重RPA扩增进行扩增；
[0018]b.结合液(含微珠)与扩增产物进行结合。
[0019]c.变性液处理得到单链产物。
[0020]d.加入洗涤缓冲液漂洗。
[0021]e.将单链产物与退火液、测序引物进行退火。
[0022]f.向每个测序管中加入测序酶和测序底物。
[0023]g.取一个dNTP排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP。将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部。
[0024]h.焦磷酸测序；
[0025]i.确定ABCB1(C3435T)位点、ABCB1(G2677T/A)位点昂丹司琼位点的基因型。
[0026]优选的，所述的反应体积为25ul，反应条件为：42℃20min。
[0027]本专利技术还公开了一种用于昂丹司琼疗效评估的试剂盒及方法的应用，所述检测试剂盒对ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677T/A)进行检测，以从基因层面指导昂丹司琼疗效评估。
[0028]重组酶聚合酶扩增(RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白
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DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在二十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
[0029]本专利技术通过多重RPA一管扩增ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677T/A)，快速、有效地在恒定温度下产生大量扩增产物。扩增产物中其中一条引物具有生物素标记。生物素标记单链DNA与链霉亲和素结合，变性去除无生物素标记单链，加入测序引物与模板DNA退火后，加入测序原料进行焦磷酸测序。
[0030]与现有技术相比，本专利技术以多重RPA扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对昂丹司琼用药相关的基因多态性进行检测，试剂盒可同时检测ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677T/A)基因多态性，为临床个性化用药给出基因角度的建议。
附图说明
[0031]图1是本专利技术提供的ABCB1(C3435T)TT型测序结果示例图；
[0032]图2是本专利技术提供的ABCB1(C34本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测昂司丹琼代谢标志物ABCB1 C3435T和ABCB1 G2677T/A两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：ABCB1 C3435T扩增引物、ABCB1 C3435T测序引物、ABCB1 G2677T/A扩增引物、ABCB1 G2677T/A测序引物和阳性对照。2.根据权利要求1所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1 C3435T扩增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。3.根据权利要求1所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1 G2677T/A扩增引物如序列表SEQ ID NO:3～4所示。4.根据权利要求1所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1 C3435T测序引物如序列表SEQ ID NO:5所示，ABCB1 G2677T/A测序引物如序列表SEQ ID NO:6所示。5.根据权利要求1所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述扩增引物为生物素标记引物。6.根据权利要求1所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述所述试剂盒还包括扩增缓冲液、18mM醋酸镁、dNTPS、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、结合单链核酸的重组酶和海藻糖。7.根据权利要求6所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙悦，刘丹，
申请(专利权)人：湖南菲思特精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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