低毒匹马霉素衍生物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及微生物次级代谢产物改造及分离技术领域，公开了一种低毒匹马霉素衍生物，分子式为C

【技术实现步骤摘要】
低毒匹马霉素衍生物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及微次级代谢产物改造及分离
，具体涉及一种低毒匹马霉素衍生物的开发及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]本专利技术涉及微生物次级代谢及分离技术，具体涉及到一种匹马霉素衍生物及其制备方法
[0003]系统性真菌感染又称侵染性真菌感染(Invasivefungalinfections(IFIs))，主要发生在一些免疫力下降或者免疫缺失的人群，诸如：癌症化疗患者、因器官移植而接受免疫抑制的患者、重症监护患者、早产儿、艾滋病患者以及获得性免疫缺陷病患者等。据统计每年有超过50万人死于侵染性真菌感染，由于缺乏有效的抗真菌药物，这个数字仍在持续上升。目前治疗系统性真菌感染的药物中，多烯类药物因为具良好的抗真菌活性且极少产生耐药性，被誉为抗真菌药物的“黄金标准”。但是其水溶性比较差同时还具有较强的细胞毒性，这严重限制了多烯类抗生素开发应用。
[0004]匹马霉素被国际卫生组织列为四种重要的多烯大环内酯类抗生素(两性霉素B、制霉菌素、匹马霉素及杀念菌素)之一。同时也是这四类化合物中，结构相对简单，毒性较低、化学性质稳定的抗生素。因此被用作食品防腐剂、抗真菌兽药、以及治疗角膜真菌感染。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种低毒匹马霉素衍生物的开发及其制备方法和应用。
[0006]本专利技术采取的技术方案是：
[0007]一种低毒匹马霉素衍生物，分子式为C
33
H
49/>NO
11
,化学结构式为：
[0008][0009]一种低毒匹马霉素衍生物的制备方法，其特征是，以StreptomyceschattanoogensisQZ02菌株为底盘构建SelP体内回补菌株，并通过菌种发酵、菌体处理、有机试剂提取、中压反相色谱粗分离、高效液相色谱分离等过程，制备得到低毒匹马霉素衍生物。具体步骤如下：
[0010]A、生产株QZ02::SelP的构建：将StreptomyceschattanoogensisQZ02整合Selvamicin生物合成基因簇中的2
‑
OG依赖的羟化酶，获得生产株QZ02::SelP；
[0011]B、生产株QZ02::SelP的发酵培养：将QZ02::SelP改造菌株的孢子接种于种子培养基中，以200
‑
220rpm转速、在28
‑
32℃下、摇床培养24h，获得发酵种子液，将种子液体按照
10
‑
15％V/V接种量，转接到发酵培养基中，以 200
‑
220rpm转速、在28
‑
32℃下、摇床培养5d，获得生产菌株的发酵培养物；
[0012]C、菌体处理：离心处理发酵培养物，使得发酵液和菌体分离，发酵液蒸干获得发酵液浸膏；菌体用水洗后冻干；
[0013]D、发酵液浸膏处理：通过等量的甲醇对发酵液浸膏萃取，过滤获得提取液，减压浓缩得到第一粗提物；
[0014]E、菌体处理：将冻干的菌体用等量的甲醇超声提取20min，过夜萃取，过滤除去滤饼，滤液减压蒸馏浓缩，和粗提物合并后得到第一总粗提物；
[0015]F、中压反相色谱分离：将第一总粗提物充分溶解于少量的甲醇，超声后静置离心除去多余的糖份，上样到中压反相色谱系统，用不同浓度的甲醇水体系洗脱，洗脱完毕标准为基线冲平，收集洗脱液并用LC
‑
Mass检测，浓缩目的产物较多的组分得到第二粗提物；
[0016]G、高效液相色谱分离：将第二粗提物用少量甲醇充分溶解，通过高效液相色谱系统分离，可得到低毒匹马霉素衍生物纯品。
[0017]进一步，通过NCBI获取SelP的基因序列，化学合成的方法合成相应的序列，再在其基因的上游构建链霉菌体系强启动子kasop,通过整合型的质粒将其整合到Streptomyces chattanoogensis QZ02的基因组上，从而获得生产菌株。
[0018]进一步，步骤B所述的种子培养基的配方包含葡萄糖20g/L，胰蛋白胨 20g/L，氯化钠10g/L；发酵培养基配方包含葡萄糖65g/L，酵母提取物10g/L，黄豆饼粉28g/L。
[0019]进一步，步骤F所用的洗脱体系为甲醇
‑
水体系，即按照0、5％、10％、 20％、30％、40％、50％、100％的甲醇梯度洗脱，洗脱充分的标准为基线冲平。
[0020]进一步，步骤G所用的高效液相色谱体系是以0.1％甲酸水和乙腈作为流动相，乙腈与0.1％甲酸水的比例为3：7，流速4mL/min，紫外检测波长为303 nm，进样量与样品浓度为25
‑
50μL，本化合物的保留时间为4
‑
6min，收集相应的色谱峰，累积后蒸干。
[0021]低毒匹马霉素衍生物在抗真菌及食品防腐剂上的应用。
[0022]本专利技术制造的匹马霉素衍生物的核磁共振数据如附图1中的表格所示。
[0023]本专利技术的有益效果是：
[0024](1)本专利技术制造的匹马霉素衍生物的最小抑制浓度为32μg/mL，具有较好的抗真菌活性；
[0025](2)本专利技术的匹马霉素衍生物作用的细胞存活率为68.12％，相对于匹马霉素降低了细胞毒性；
[0026](3)可以开发为抗真菌药物和防腐剂的先导化合物，具有一定的应用潜力。
附图说明
[0027]附图1匹马霉素衍生物的核磁共振数据表的图样；
[0028]附图2pSET152
‑
SelP的质粒图谱；
[0029]附图3匹马霉素衍生物的的核磁共振氢谱(1H NMR)图；
[0030]附图4匹马霉素衍生物的的核磁共振碳谱(
13
C NMR)图。
具体实施方式
[0031]下面结合附图对本专利技术低毒匹马霉素衍生物及其制备方法和应用的具体实施方式作详细说明。
[0032]本专利技术低毒匹马霉素衍生物是这样制备的：
[0033]A、生产株QZ02::SelP的构建：QZ02来源于上海交通大学的前期研究，参考这里的生产株可以参照中国专利文献CN104447917B。将Streptomyceschattanoogensis QZ02底盘菌株整合Selvamicin生物合成基因簇中的2
‑
OG依赖的羟化酶，获得生产株QZ02::SelP。
[0034]B、生产株QZ02::SelP的发酵培养：将QZ02::SelP的孢子接种于种子培养基中，在28
‑
32℃下以200
‑
220rpm转速摇床培养24h，获得发酵种子液，将种子液体按照10
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15％V/V接种量，转接到发酵培养基中，以200
‑
220rpm转速、在28
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32℃下、摇床培养5d，获得生产菌株的发酵培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低毒匹马霉素衍生物，分子式为C
33
H
49
NO
11
,化学结构式为：2.一种如权利要求1所述的低毒匹马霉素衍生物的制备方法，其特征在于：经过产生菌株Streptomyces chattanoogensis QZ02构建SelP蛋白体内回补株、菌种发酵、菌体处理、有机试剂提取、中压反相色谱粗分离、高效液相色谱分离得到低毒匹马霉素衍生物。具体步骤如下：A、生产株QZ02::SelP的构建：将Streptomyces chattanoogensis QZ02整合Selvamicin生物合成基因簇中的2
‑
OG依赖的羟化酶，获得生产株QZ02::SelP；B、生产株QZ02::SelP的发酵培养：将QZ02::SelP的孢子接种于种子培养基中，以200
‑
220rpm转速摇床培养24h，获得发酵种子液，将种子液体按照10
‑
15％V/V接种量，转接到发酵培养基中，以200
‑
220rpm转速、在28
‑
32℃下、摇床培养5d，获得生产菌株的发酵培养物；C、菌体处理：离心处理发酵培养物，使得发酵液和菌体分离，发酵液蒸干获得发酵液浸膏；菌体用水洗后冻干；D、发酵液浸膏处理：通过等量的甲醇对发酵液浸膏萃取，过滤获得提取液，减压浓缩得到第一粗提物；E、菌体处理：将冻干的菌体用等量的甲醇超声提取20min，过夜萃取，过滤除去滤饼，滤液减压蒸馏浓缩，和粗提物合并后得到第一总粗提物；F、中压反相色谱分离：将第一总粗提物充分溶解于少量的甲醇，超声后静置离心除去多余的糖分，上样到中压反相色谱系统，用不同浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立新，刘光，方文静，许安安，白林泉，杰森，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：