抗CK20蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种可以识别人CK20抗原的单克隆抗体，分泌细胞株、其制备方法以及其在免疫检测中的用途。上述技术方案选取CK20蛋白C末端的1

【技术实现步骤摘要】
抗CK20蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗CK20蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]细胞角蛋白(Cytokeratin)是一种中间丝蛋白要表达于上皮细胞有很高程度的组织特异性和分化特异性。在人类上皮中共发现19种角蛋白多肤。根据它们的分子量和等电点分为两型:I型为酸性分子量40
‑
56.5KD，等电点≤5.5，包括CK9
‑
CK20；II型为中性或碱性，分子量53
‑
67KD，包括CK1
‑
CK8的角蛋白多肽。大多数角蛋白的编码基因已被分离、克隆和系列化它们大多数是单克隆基因。人类I型和II型角蛋白多肤的编码基因分别位于第17号和第12号染色体上。每种角蛋白多肤由一个基因编码。通常CK在上皮中以角蛋白对的形式表达，一个I型角蛋白和一个II型角蛋白结合。角蛋白表达的组织特异性和分化特异性以及在各种不同的疾病中角蛋白表达的变化具有诊断意义。同时角蛋白有许多优点，作为标记蛋白它的数量多，稳定性好并有高抗原性，角蛋白抗体因此被广泛应用作为各种上皮和肿瘤细胞的标记。由于上皮细胞的CK组型在其起源的肿瘤中基本上得到保持，因而应用合适的CK抗体不仅能帮助鉴别是否是癌肿而且还能进行CK亚型分析，帮助确定癌肿的组织起源。
[0003]CK20具有严格的上皮特异性分布。正常组织中CK20见于肠粘膜细胞、胃粘膜及幽口腺体细胞、十二指肠粘膜细胞、泌尿系伞状细胞、表皮Merkel细胞等。CK20在细胞发生化生、恶变、肿瘤转移、体外培养等改变时，这种表达持续存在，非上皮来源的细胞或组织如血液、骨髓细胞及淋巴结则不表达，一旦于血液、淋己液及骨髓组织中发现，就提示上述组织中有上皮细胞或上皮性肿瘤细胞存在，因此它可作为检测血液、淋巴结中上皮性肿瘤转移的标志物。

技术实现思路

[0004]专利技术人提供了一种抗CK20单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
[0005]进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0006]进一步地，所述单克隆抗体特异性识别CK20蛋白。
[0007]进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG
2a
亚型单克隆抗体。
[0008]进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO 20764的杂交瘤细胞株产生。
[0009]专利技术人又提供了一种抗CK20蛋白单克隆抗体的制备方法，其用于免疫小鼠的抗原为重组蛋白，所述重组蛋白由大肠杆菌重组表达，包含GST蛋白标签、CK20蛋白片段及组氨酸蛋白标签。
[0010]进一步地，所述CK20蛋白片段为CK20蛋白的第1位至第424位氨基酸片段，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0011]专利技术人还提供了一株分泌抗CK20蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株10A2，所述细胞株已于2020年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 20764，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0012]专利技术人还提供了上述单克隆抗体在CK20蛋白免疫检测中的用途。
[0013]进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。
[0014]专利技术人最后提供了一种CK20蛋白免疫组化检测试剂，所述免疫组化检测试剂含有重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的抗CK20蛋白单克隆抗体为其有效成分。
[0015]区别于现有技术，本专利技术所产生的有益技术效果为：上述技术方案选取CK20蛋白C末端的1
‑
424位氨基酸为抗原肽，进行密码子优化，成为适合在大肠杆菌BL21(DE3)表达的基因片段，最后得到的重组蛋白包含GST蛋白标签、CK20蛋白片段及组氨酸蛋白标签。所述重组蛋白对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗CK20蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株10A2,以及由该细胞株所分泌的抗CK20蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CK20蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。
附图说明
[0016]图1为实施例1融合组氨酸标签的重组CK20蛋白纯化结果胶图，其中M表示Marker；1为超声后上清液样本；2为超声后沉淀样本。
[0017]图2为胃腺癌免疫组化染色结果对比图；其中左为10A2分泌的CK20，右为市售CK20。
[0018]图3为胃表面上皮免疫组化染色结果对比图；其中左为10A2分泌的CK20，右为市售CK20。
具体实施方式
[0019]为详细说明技术方案的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
[0020]实施例1重组CK20蛋白片段的制备
[0021]一、基因优化与合成
[0022]CK20按照Uniprot数据库中登录号为P35900的蛋白质序列，选择1
‑
424位氨基酸的蛋白片段，直接优化成适合在大肠杆菌BL21(DE3)表达的基因片段。在PCR的过程中在基因5
’
和3
’
端分别加入EcoR I和XhoI酶切位点。
[0023]PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体Pet30a
‑
GST进行EcoRⅠ和XhoI酶切，再次电泳回收，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑取平板上的克隆接种，进行菌液PCR鉴定。挑选PCR结果阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆使用。
[0024]选择不同的抗原进行免疫可能制备出不同结合特性的抗体，该分子同时存在多种因可变剪切引起的变异体，最终导致不同抗体对表达抗原细胞的识别能力和模式不同。CK20分子按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，选择CK20的1
‑
424位氨基酸残基进行密码子优化，分子量约为74kDa。通过序列优化设计利用原核表达基因序列获得CK20蛋白。而重组免疫原由具有抗原性的CK20蛋白片段及用于重组蛋白纯化的蛋白标签组成，蛋白标签为GST和HIS。
[0025]二、蛋白表达和纯化
[0026]按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗CK20蛋白单克隆抗体，，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别CK20蛋白。4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG
2a
亚型单克隆抗体。5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO20764的杂交瘤细胞株产生。6.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽杰，杨清海，陈惠玲，王小亚，陈泳，
申请(专利权)人：福州迈新生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：