从FFPE样本中快速提取核酸的试剂、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体公开了一种从FFPE样本中快速提取核酸的试剂、试剂盒及其应用。本发明专利技术的试剂中结合缓冲液的配方简单，成本低廉，可以显著提高核酸与磁珠的结合效果，增加核酸的结合量。本发明专利技术将特定组成的裂解缓冲液、结合缓冲液和洗涤缓冲液组合使用，先充分裂解组织细胞，消化与核酸结合的蛋白质，完全释放出核酸，再将释放出的核酸特异性地结合到磁珠上，增大核酸的结合量，实现核酸与其他裂解物的有效分离，之后多次洗涤结合有核酸的磁珠，彻底去除蛋白质、脂质等杂质，最后从磁珠上洗脱核酸，得到高纯度、高收率的核酸。本发明专利技术的试剂/试剂盒组成简单，成本低廉，便于核酸提取操作，可以大幅度缩短提取时间。可以大幅度缩短提取时间。可以大幅度缩短提取时间。

【技术实现步骤摘要】
从FFPE样本中快速提取核酸的试剂、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种从FFPE样本中快速提取核酸的试剂、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]随着精准医疗对病理科的影响渗透以及研究手段的不断升级，病理医生除了关注传统组织形态外，对FFPE(Formalin Fixation and Paraffin Embedding，福尔马林固定石蜡包埋)样本在分子层面的研究也越来越多。FFPE样本大部分与肿瘤相关，所以研究这些组织样本为探讨新的肿瘤分类、诊断和预后标准，开发肿瘤早期检测的实验技术、转化医学和个体化医学提供了有利的依据。
[0003]FFPE样本虽然使组织得以长期保存，但其特殊的制作方法和保存方式也会对核酸分子造成多方面的影响。首先，福尔马林固定液中含有的甲醛具有较高的反应活性，可以与带有
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OH、
‑
SH、
‑
NH2的分子发生亲核加成反应，并最终成为
‑
CH2‑
的提供者。当甲醛与上述基团中的两个发生反应后，自由的分子链也被交联起来，从而发挥对组织的固定作用，该过程也会对核酸分子产生不利的影响，Watford等(1998)的研究发现，核酸对甲醛的反应性最初表现为核酸分子呈可逆性亚氨基和氨基的羟甲基化，随着固定时间的延长，生物大分子之间缓慢形成广泛的亚甲基交联桥，这也使核酸链的脆性增加，在受到剪切力作用时更容易发生随机断裂。一般而言，甲醛介导的DNA损伤在固定3h后已经发生，固定时间越长，DNA损伤越严重，越不易获得大片段DNA。其次，用于组织包埋的固体石蜡为多种烷烃的混合物，其熔点为50
‑
65℃，化学性质稳定，在通常条件下不与酸性或碱性溶液发生反应，且目前尚无石蜡能直接导致包埋组织中DNA降解的报道。但是有文献记载，在石蜡包埋过程中DNA更容易发生降解，其原因可能是组织浸蜡与包埋时需要加热到62℃左右，此温度下DNA部分解链，组织内残留的痕量甲醛对解链后的DNA单链进行甲基化修饰，修饰后的DNA单链在冷却后不易复性而发生降解。另外，石蜡会阻碍消化液对组织的渗透，减少蛋白酶K(PK)与组织内蛋白的接触，从而影响组织消化和DNA释放。
[0004]为了解除甲醛固定所致DNA
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蛋白质、RNA
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蛋白质、蛋白质
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蛋白质之间的交联，美国专利US2005014203A1(Expression Pathology)公开了一种解交联方法，先将固定的生物样品加热(如95℃加热1.5h)，以便部分断开生物分子之间的交联，然后将处理过的样品与蛋白水解酶如蛋白酶K一起孵育，分解组织和细胞结构。由于该方法需要在相对较高的温度下解交联，且在中等温度下解交联速度非常缓慢，因此，美国专利US20090202998A1(Qiagen)公开了一种能在相对较低的温度下解交联的方法，包括：使固定的生物样品与亲核试剂(选自乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、2
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氨基
‑
1,3
‑
丙二醇、氨基胍等)接触，在65
‑
85℃下孵育一段时间，快速断开交联。此外，由于交联可通过加热的方式逆转，样品中过量的甲醛将阻碍任何涉及氨基的功能蛋白质、核酸等的加工或分析。为防止过量的甲醛再次形成交联、阻止有效的交联逆转，中国专利CN102803490B(Qiagen)公开了一种核酸提取方法，将生物样品与包含清除剂(如己二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼)的溶液接触，通过与甲醛反应将
其去除。
[0005]为了消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不利影响，必须保证在不增加外源性PCR抑制因子和尽量减少DNA损伤的前提下对组织进行彻底地脱蜡。目前，脱蜡通常使用芳族溶剂，如甲苯、二甲苯等。脱蜡时将FFPE样本浸入二甲苯浴中直至石蜡溶解，之后用一系列醇浓度降低的醇水溶液洗涤样本以除去二甲苯，最后用水洗涤，以使样本可用于含水反应物或试剂溶液。但是二甲苯是一种易燃易挥发且有毒的有机溶剂，容易使核酸片段化降低得率，并会对操作人员产生一定的危害。并且当组织切片的厚度超过10μm时，二甲苯等芳族溶剂难以渗透，会导致脱蜡不彻底，从而影响后续蛋白酶的消化效果。为此，中国专利CN102939381B(Qiagen)公开了一种脱蜡技术，使蜡增溶剂(选自直链、支链或环状的C10
‑
C16烷烃或其混合物)与样本接触，室温孵育一段时间后加入水性裂解缓冲液，裂解得到包含水相和有机相的混合物，其中水相含有核酸，有机相含有溶蜡和蜡增溶剂。蜡增溶剂的沸点优选高于150℃，以确保在与样本接触时为液态，这样石蜡一旦液化便可保持液态，且不会因为蜡增溶剂的非有意挥发而再度硬化。然而直链烷烃的沸点与运动粘度有关，沸点越高、运动粘度也越高，因此用纯的直链烷烃无法获得与水相当的运动粘度，从而不利于其递送和去除。为便于自动化分离，美国专利US9097628B2(Qiagen)公开了一种在室温下具有相对较低的运动粘度、但具有相对较高的沸点的聚有机硅氧烷脱蜡剂，包括聚二甲基硅氧烷、聚二乙基硅氧烷、聚甲基氢硅氧烷、聚甲基烷基硅氧烷、聚甲基芳基硅氧烷等，该脱蜡剂适用于自动化样品处理如移液机器人。除此以外，甲苯、二甲苯等芳族溶剂的替代物还包括萜烯油(如d
‑
柠檬烯)、矿物油等，或者可以参照美国专利US9243241B2(Invitrogen)公开的方法采用加热的方式熔化石蜡，离心后待石蜡重新凝固漂浮在液面上方或者沉积在管壁上，再分离水相与石蜡相。
[0006]除上述脱蜡、解交联外，从FFPE样本中提取核酸的操作还包括裂解/消化、结合、洗涤和洗脱。通常情况下，从FFPE样本中分离出的DNA呈高度降解状态，平均片段大小在60
‑
200bp之间(Byers R等，2004)，而扩增片段越小，越难针对限制区域设计引物，因此核酸提取方法也是影响基因分析的重要因素。在现有技术中，核酸提取方法包括蛋白酶K
‑
酚氯仿抽提法、chelex抽提法、固相载体吸附法等。其中，蛋白酶K
‑
酚氯仿抽提法需要使用有毒有害的有机溶剂，操作复杂且容易丢失大量DNA，不适用于高度降解的样本。chelex抽提法操作快速，但容易残留扩增抑制物，不利于下游PCR分析。固相载体吸附法以固相吸附载体为基础，包括旋转离心柱提取法、玻璃珠吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法和纳米磁珠提取法。这类方法的操作步骤主要分为四个部分：(1)利用裂解/消化缓冲液促使组织细胞破裂，使核酸释放于液相中；(2)利用固相吸附载体对核酸具有较强亲和力、吸附力的特性，将释放出来的核酸特异性地结合在固相吸附载体上，而蛋白质、多糖、脂质等杂质仍然保留在液相中，并随着上清液的移除而被去除；(3)使用一种或多种洗涤缓冲液多次洗涤固相吸附载体，彻底去除影响核酸分析的杂质；(4)使用洗脱缓冲液，通过调节离子强度和pH值，将结合在固相吸附载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从FFPE样本中快速提取核酸的试剂，其特征在于：所述试剂包括结合缓冲液，所述结合缓冲液包括以下组分：胍盐1
‑
5M，吐温系列表面活性剂0.1
‑
2％(v/v)，聚乙二醇辛基苯基醚1
‑
5％(v/v)，乙二胺四乙酸10
‑
40mM，Tris
‑
HCl 20
‑
60mM，pH值为8.0
‑
9.5。2.根据权利要求1所述的从FFPE样本中快速提取核酸的试剂，其特征在于：所述胍盐为盐酸胍、硝酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种；进一步优选地，所述胍盐为盐酸胍或异硫氰酸胍；和/或，所述吐温系列表面活性剂选自吐温20、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或多种；进一步优选地，所述吐温系列表面活性剂为吐温20或吐温40；和/或，所述结合缓冲液中还包括聚乙二醇，分子量为2000
‑
10000，浓度为0.1
‑
2％(w/v)；进一步优选地，所述聚乙二醇的分子量为6000
‑
8000；和/或，所述结合缓冲液中还包括十二烷基硫酸根离子沉淀剂，选自可溶性钾盐、铷盐、铯盐、钙盐、锶盐、钡盐中的一种或多种；进一步优选为钾盐或锶盐；所述钾盐为氯化钾、硫酸钾、乙酸钾中的一种或多种，优选为氯化钾或乙酸钾；所述锶盐为氯化锶、乙酸锶中的一种或多种，优选为氯化锶。3.根据权利要求2所述的从FFPE样本中快速提取核酸的试剂，其特征在于：所述结合缓冲液包括以下组分：盐酸胍或异硫氰酸胍1
‑
4M，氯化钾或氯化锶0.1
‑
0.5M，吐温20或吐温40 0.1
‑
1％(v/v)，聚乙二醇辛基苯基醚1
‑
4％(v/v)，乙二胺四乙酸10
‑
40mM，聚乙二醇6000
‑
8000 0.1
‑
2％，氯化钾或氯化锶0.1
‑
2M，Tris
‑
HCl 20
‑
60mM，pH值为8.5
‑
9.5；进一步优选地，所述结合缓冲液包括以下组分：盐酸胍或异硫氰酸胍1
‑
4M，氯化锶0.1
‑
0.5M，吐温20 0.1
‑
1％(v/v)，聚乙二醇辛基苯基醚1
‑
4％(v/v)，乙二胺四乙酸10
‑
40mM，聚乙二醇6000或聚乙二醇8000 0.1
‑
2％，氯化锶0.1
‑
2M，Tris
‑
HCl 20
‑
60mM，pH值为8.5
‑
9.5。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的从FFPE样本中快速提取核酸的试剂，其特征在于：所述试剂还包括磁珠和/或核酸助沉剂，所述磁珠选自硅羟基磁珠、羧基修饰磁珠中的任意一种，表面无孔或多孔；所述核酸助沉剂选自C1
‑
C5的一元醇、C1
‑
C9的多元醇中的一种或多种；所述C1
‑
C5的一元醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇中的一种或多种，优选为乙醇或异丙醇；所述C1
‑
C9的多元醇选自2
‑
甲基
‑
1,3
‑
丙二醇、2,3
‑
丁二醇、1,2
‑
丙二醇、三丙二醇中的一种或多种，优选为2
‑
甲基
‑
1,3
‑
丙二醇。5.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的从FFPE样本中快速提取核酸的试剂，其特征在于：所述试剂还包括脱蜡剂、裂解缓冲液、蛋白酶、甲醛清除剂、解交联试剂、漂洗缓冲液、洗脱缓冲液中的一种或多种；所述脱蜡剂选自萜烯油、矿物油、C7
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C10的直链/支链烷烃或其混合物、柠檬精油、6
‑
溴己基乙酸酯、C10
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C16的直链/支链/环状烷烃或其混合物、聚有机硅氧烷脱蜡剂中的一种或多种；所述裂解缓冲液包括以下组分：十二烷基硫酸根离子源的阴离子型表面活性剂、缓冲物质和硫酸，所述硫酸用于调节裂解缓冲液的pH值为7.5
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10.0；所述十二烷基硫酸根离子源的阴离子型表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸铵、十二烷基硫酸锂中的一种或多种，优选为十二烷基硫酸钠；所述缓冲物质为Tris、Hepes、Hpps、Mops、Mes中的任意一种，优选为Tris；所述甲醛清除剂选自己二酸二酰肼、琥珀酸二酰肼中的一种或多种；
所述解交联试剂选自乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、2
‑
氨基
‑
1,3
‑
丙二醇、氨基胍中的一种或多种；所述洗涤缓冲液中包括胍盐和有机溶剂，所述胍盐选自盐酸胍、硝酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种，优选为盐酸胍或异硫氰酸胍；所述有机溶剂选自C1
‑
C5的一元醇、C1
‑
C9的多元醇中的一种或多种；所述C1
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C5的一元醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇中的一种或多种，优选为乙醇或异丙醇；所述C1
‑
C9的多元醇选自2<...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔国鹏，董超，张银，张晓亮，杨增利，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：