一种检测肠毒素SEA的PSR引物、检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测肠毒素SEA的PSR引物、检测试剂盒和检测方法，所述引物包括检测引物Ft和检测引物Bt，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术针对肠毒素SEA设计的PSR检测引物和方法解决了现有技术方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等问题。通过选择目标菌株的SEA肠毒素特异性序列的保守区域，设计一对检测引物Ft和Bt构建PSR反应体系，并在60分钟左右获得检测结果，较传统MRSA肠毒素的检测方法大大缩短了检测周期。周期。周期。

【技术实现步骤摘要】
一种检测肠毒素SEA的PSR引物、检测试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种检测肠毒素SEA的PSR引物、检测试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌是医院和社区常见的感染菌，近年来随着抗生素的广泛使用，耐药株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meticillin
‑
resistant staphylococcus aureus，MRSA)的分离率日趋升高。金黄色葡萄球菌在一定条件下可以分泌一种SEs肠毒素。目前已发现的肠毒素有SEA，SEB，SEC，SED，SEE等类型。此类肠毒素可以造成食物中毒，引起呕吐症状。多项研究表明在MRSA中SEA肠毒素的检测率更高。因此食品中MRSA的SEA肠毒素检测技术成为食源性疾病预防与控制的关键。因此，开发一种高效、灵敏的快速检测MRSA的SEA毒素试剂盒及方法非常重要。
[0003]目前微生物的检测鉴定方法主要分为传统培养法、免疫学检测法以及分子生物学技术。传统培养法操作步骤繁琐、检测灵敏度低、实验周期长。免疫学检测法被广泛应用于肠毒素SEA的检测，但是其对实验人员专业水平要求高，成本较高，准确性较低。分子生物学中荧光定量PCR也被用于肠毒素SEA的检测，但同样存在对操作人员水平要求高，成本高的缺点。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种检测肠毒素SEA的PSR引物、检测试剂盒和检测方法，通过对引物的优化提高了灵敏度(达到了630pg/μL)，同时该方法具有操作简便，特异性好，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用的特点。
[0005]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0006]一种检测肠毒素SEA的PSR引物，包括检测引物Ft和检测引物Bt，其核苷酸序列分别如下所示：
[0007]检测引物Ft：5
’‑
gtctagccataaattgattgg gtggtacaccaaacaa aaca
‑3’
(SEQ ID NO.1)；
[0008]检测引物Bt：5
’‑
ggttagttaaataccgatctggcttgaaga tccaa ctcctg
‑3’
(SEQ ID NO.2)；
[0009]一种检测肠毒素SEA的试剂盒，包括上述的PSR引物；
[0010]所述试剂盒中，各PSR引物的浓度优选50μM；
[0011]所述的试剂盒还包括如下组分：
[0012]A、2
×
反应缓冲液：40.0mM的Tris
‑
HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；
[0013]B、Bst DNA聚合酶；
[0014]C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液；
[0015]所述的Bst DNA聚合酶，其浓度优选8U/μL；
[0016]所述钙黄绿素和氯化锰的混合溶液，制备方法如下：
[0017](i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mM的氯化锰水溶液；
[0018](ii)取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL1 mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(溶液中钙黄绿素与氯化锰的质量比为1:8)。
[0019]上述的试剂盒可以用于检测肠毒素SEA。
[0020]一种检测肠毒素SEA的PSR方法，包括如下步骤：
[0021](1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA；
[0022]所述的模板DNA，OD
260
/OD
280
值为1.8～2.0；
[0023](2)建立检测SEA毒素的的PSR扩增反应体系，于60～68℃水浴中保温至少60分钟进行PSR反应；
[0024]其中，PSR扩增反应体系为：2
×
反应缓冲液12.5μL，50μM的检测引物Ft和50μM的检测引物Bt各0.8μL，DNA模板2.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；
[0025](3)待反应完成后于75～85℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色，如颜色为黄色，说明待检样品中不含有肠毒素SEA；如颜色变为绿色，则说明待检样品中含有肠毒素SEA；
[0026]优选地，步骤(3)终止反应后，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，呈现梯形条带的说明待检样品中含有肠毒素SEA；无扩增条带的说明待检样品中不含有肠毒素SEA。
[0027]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0028](1)本专利技术针对肠毒素SEA设计的PSR检测引物和方法解决了现有技术方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等问题。通过选择目标菌株的SEA肠毒素特异性序列的保守区域，设计一对检测引物Ft和Bt构建PSR反应体系，并在60分钟左右获得检测结果，较传统MRSA肠毒素的检测方法大大缩短了检测周期。
[0029](2)相较于普通PCR，PSR技术在灵敏度方面具有显著的优越性。而本专利技术可以降低出现假阳性结果的概率，同时确保了检测的可靠性、特异性和高灵敏度。这对早期的疾病诊断和提高重大群体疾病的诊断率具有非常重要的意义。
[0030](3)本专利技术在恒温条件下扩增，不需要花费大量的时间去改变反应体系温度，耗时较短。此外，该技术不需要昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要进行凝胶电泳，直接使用荧光染料，通过显色反应可凭肉眼判断结果，操作简便，且成本较低。因此，本专利技术的试剂盒及方法可以很好的应用于现场检测，给中小单位带来了便利。
附图说明
[0031]图1为PSR反应技术检测肠毒素SEA的显色结果；
[0032]图2为PSR技术检测肠毒素SEA的凝胶电泳结果；
[0033]其中，1为MRSA132115，2为MRS0315022822，3为MRSA 0613120003，4为MRSA 0314020129，5为干酪乳杆菌BM
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LC14617，6为沙门氏菌ATCC29629；7为沙门氏菌ATCC19585；8为沙门氏菌ATCC14028；9为沙门氏菌ATCC29629；10为单增李斯特菌ATCC19116；11为单增
李斯特菌ATCC19114，12为单增李斯特菌ATCC19115；13为单增李斯特菌ATCC15313；14为单增李斯特菌ATCC19113；15为铜绿假单胞菌ATCC27853；16为大肠杆菌ATCC43895；17为大肠杆菌E019；18为大肠杆菌E20；19为大肠杆菌E43；20为大肠杆菌E44；21为副溶血性弧菌ATCC17802；22为副溶血性弧菌ATCC27969，23为空白对照。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测肠毒素SEA的PSR引物，其特征在于包括检测引物Ft和检测引物Bt，其核苷酸序列分别如下所示：检测引物Ft：5
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gtctagccataaattgattgg gtggtacaccaaacaa aaca
‑3’
(SEQ ID NO.1)；检测引物Bt：5
’‑
ggttagttaaataccgatctggcttgaaga tccaa ctcctg
‑3’
(SEQ ID NO.2)。2.一种检测肠毒素SEA的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的PSR引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述PSR引物的浓度为50μM。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包括如下组分：A、2
×
反应缓冲液：40.0mM的Tris
‑
HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；B、Bst DNA聚合酶；C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的Bst DNA聚合酶，其浓度为8U/μL。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述钙黄绿素和氯化锰的混合溶液，制备方法如下：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，配制50μM的钙黄绿素溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振波，游姗迟，骆玉婷，刘君彦，陈玲，叶燕锐，李晓玺，洪玮，彭芳，付欣，户帅锋，苏健裕，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：