一种CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP-RBD蛋白的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP

【技术实现步骤摘要】
Fusion培养基。
[0014]优选地，所述的细胞扩增培养的具体过程如下：将细胞复苏培养物，转接至新鲜的 无血清培养基中，初始密度不低于3.0
×
105个/ml，置于37
±
1℃，5
±
1％CO2，100～150rpm 条件下悬浮培养2～4天，如此进行2～5次传代扩增培养，得到细胞扩增培养物；其中， 所述的无血清培养基为EX
‑
CELL CD CHO Fusion培养基。
[0015]优选地，所述的罐培养的具体过程如下：
[0016]将检定合格的细胞扩增培养物，转接至新鲜的无血清培养基中，进行罐培养，初始 密度不低于3.0
×
105个/ml，置于生长温度36.5
±
1℃，溶氧不低于45％，pH值不低于6.5 条件下进行罐培养；
[0017]当培养3～4天时，开始补加补料培养基，补加体积为初始体积的10
±
1％，每次补料 间隔1～2天；当培养4～5天时，开始补糖，使培养期间葡萄糖浓度不低于1g/L；
[0018]罐培养时间达到7～13天且细胞活率为90
±
10％时，进行收获，得到细胞收获液，作 为生产收获物；
[0019]其中，所述的无血清培养基为EX
‑
CELL
‑
Advanced CHO基础培养基；
[0020]所述的补料培养基为EX
‑
CELLAdvanced CHO Feed 1补料培养基；
[0021]检定合格的细胞扩增培养物为细胞密度不小于1.0
×
106个/ml且细胞活率不低于 90％的细胞扩增培养物。
[0022]优选地，所述的纯化包括如下步骤：
[0023]澄清过滤：对细胞收获液进行离心、过滤，得到NCP
‑
RBD澄清液；
[0024]超滤浓缩：对澄清过滤得到的NCP
‑
RBD澄清液进行浓缩和超滤，得到浓缩液；
[0025]离子交换层析：对浓缩液进行离子交换层析处理，得到纯化液；
[0026]灭活：对纯化液进行灭活，得到灭活液；
[0027]过滤病毒和细菌：对灭活液进行过滤除去病毒和细菌，得到所需产物。
[0028]优选地，所述的澄清过滤的具体过程如下：采用低速离心及深层过滤进行细胞收获 澄清液，获得NCP
‑
RBD澄清液；
[0029]其中，低速离心的条件为200～1000g，5～20min；
[0030]深层过滤采用Supracap 100囊式滤器，标称精度为0.5～15μm，缓冲液为10～30mMPB缓冲液。
[0031]优选地，所述的超滤浓缩的具体过程如下：
[0032]采用10～50kDa超滤膜包对NCP
‑
RBD澄清液进行浓缩和超滤，浓缩倍数为2～10倍， 超滤缓冲液为10～30mM PB缓冲液，洗滤倍数为2～10倍，获得浓缩液。
[0033]优选地，所述的离子交换层析包括以下步骤：
[0034]阴离子交换层析：将浓缩液经过阴离子交换层析柱，使其与阴离子交换填料相互作 用后以流穿模式收集流穿液，即为第一步柱纯化液；
[0035]阳离子交换层析：将第一步柱纯化液再次经过阳离子交换层析柱，使其与阳离子交 换填料相互作用后洗脱，收集目的蛋白洗脱液，即为第二步柱纯化液。
[0036]优选地，所述的阴离子交换层析中阴离子交换填料为带有
‑
CH2N+(CH3)3季铵基功能 基团的阴离子交换填料；
[0037]所述的阴离子交换层析具体包括以下步骤：
[0038]用10～30mM PB缓冲液平衡层析柱至基线平稳；
[0039]将浓缩液经过阴离子交换层析柱，使其与阴离子交换填料相互作用，并收集流穿液， 即为第一步柱纯化液。
[0040]优选地，所述的阳离子交换层析中阳离子交换填料为带有
‑
CH2CH2CHSO3黄丙基功 能基团的阳离子交换填料；
[0041]所述的阳离子交换层析具体包括以下步骤：
[0042]用10～30mM PB缓冲液平衡层析柱至基线平稳；
[0043]将第一步柱纯化液经过阳离子交换层析柱，使其与阳离子交换填料相互作用；
[0044]上样结束后，用10～30mM PB缓冲液平衡缓冲液再次平衡层析柱至基线平稳；
[0045]使用含NaCl的10～30mM PB缓冲液洗脱，收集目的蛋白洗脱液，即为第二步柱纯 化液，其中，NaCl的浓度不低于0.1M。
[0046]优选地，所述的灭活的具体过程如下：将第二步柱纯化液稀释至蛋白质含量为 400～800μg/ml时，用磷酸溶液将其pH值调节至3～4，混匀后，置于15～26℃，灭活2～4h； 用NaOH溶液回调pH值至6～8，即得灭活液。
[0047]优选地，所述的过滤病毒和细菌的具体过程如下：将灭活液依次进行经过SV4除病 毒过滤器去除病毒和Supor EKV膜AcroPak20过滤器过滤除菌。
[0048]本专利技术的目的之二是：提供一种CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP
‑
RBD蛋 白，所述的蛋白采用上述方法制备而成。
[0049]本专利技术的目的之三是：提供一种CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP
‑
RBD蛋 白的应用，用于制备新冠疫苗。
[0050]本专利技术的有益效果在于：
[0051]采用本专利技术所述方法，可以将CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP
‑
RBD蛋白 高效的分离和纯化，适用于规模化生产，同时能有效地用于生产新冠疫苗。
附图说明
[0052]图1重组新型冠状病毒蛋白填料筛选Q柱层析样品纯度(电泳法)检测图谱， M:Marker26616；其中，每条电泳条带代表柱层析步骤中的每步收集的样品，具体含义 如下：1.Q流穿；2.Q
‑
0.2M NaCl
‑
1；3.Q
‑
0.2M NaCl
‑
2；4.Q
‑
0.2M NaCl
‑
3；5.Q
‑
0.2M NaCl
‑
4； 6.Q
‑
0.4M NaCl；
[0053]图2重组新型冠状病毒蛋白填料筛选DEAE柱层析样品纯度(电泳法)检测图谱， M:Marker26616；其中，每条电泳条带代表柱层析步骤中的每步收集的样品，具体含义 如下：1.DEAE流穿；2.DEAE
‑
0.2M NaCl
‑
1；3.DEAE
‑
0.2M NaCl
‑
2；4.DEAE
‑
0.2MNaCl
‑
3。
[0054]图3重组新型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP
‑
RBD蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)细胞复苏培养：取工作细胞株进行复苏培养，得到细胞复苏培养物；(2)细胞扩增培养：将细胞复苏培养物进行扩增，得到细胞扩增培养物；(3)罐培养：将细胞扩增培养物进行罐培养，得到细胞收获液；(4)纯化：对细胞收获液进行纯化，得到所需产物；其中，工作细胞株为表达重组新型冠状病毒NCP
‑
RBD蛋白的重组CHO细胞株。2.根据权利要求1所述的CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP
‑
RBD蛋白的制备方法，其特征在于，所述的细胞复苏培养的具体过程如下：取工作细胞株接种至新鲜的无血清培养基中，初始密度不低于3.0
×
105个/ml，置于37
±
1℃，5
±
1％CO2，100～150rpm条件下悬浮培养2～4天，得到细胞复苏培养物；其中，所述的无血清培养基为EX
‑
CELL CD CHO Fusion培养基。3.根据权利要求1所述的CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP
‑
RBD蛋白的制备方法，其特征在于，所述的细胞扩增培养的具体过程如下：将细胞复苏培养物，转接至新鲜的无血清培养基中，初始密度不低于3.0
×
105个/ml，置于37
±
1℃，5
±
1％CO2，100～150rpm条件下悬浮培养2～4天，如此进行2～5次传代扩增培养，得到细胞扩增培养物；其中，所述的无血清培养基为EX
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CELL CD CHO Fusion培养基。4.根据权利要求1所述的CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP
‑
RBD蛋白的制备方法，其特征在于，所述的罐培养的具体过程如下：将检定合格的细胞扩增培养物，转接至新鲜的无血清培养基中，进行罐培养，初始密度不低于3.0
×
105个/ml，置于生长温度36.5
±
1℃，溶氧不低于45％，pH值不低于6.5条件下进行罐培养；当培养3～4天时，开始补加补料培养基，补加体积为初始体积的10
±
1％，每次补料间隔1～2天；当培养4～5天时，开始补糖，使培养期间葡萄糖浓度不低于1g/L；罐培养时间达到7～13天且细胞活率为90
±
10％时，进行收获，得到细胞收获液，作为生产收获物；其中，所述的无血清培养基为EX
‑
CELL
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Advanced CHO基础培养基；所述的补料培养基为EX
‑
CELLAdvanced CHO Feed 1补料培养基；检定合格的细胞扩增培养物为细胞密度不小于1.0
×
106个/ml且细胞活率不低于90％的细胞扩增培养物。5.根据权利要求1所述的CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP
‑
RBD蛋白的制备方法，其特征在于，所述的纯化包括如下步骤：澄清过滤：对细胞收获液进行离心、过滤，得到NCP
‑
RBD澄清液；超滤浓缩：对澄清过滤得到的NCP
‑
RBD澄清液进行浓缩和超滤，得到浓缩液；离子交换层析：对浓缩液进行离子交换层析处理，得到纯化液；灭活：对纯化液进行灭活，得到灭活液；过滤病毒和细菌：对灭活液进行过滤除去病毒和细菌，得到所需产物。6.根据权利要求5所述的CHO细胞表达的重组新型冠状病毒NCP
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙安徽，孙佳亓，周航，吴常伟，黄恩启，
申请(专利权)人：重庆智飞生物制品股份有限公司北京智飞绿竹生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：