【技术实现步骤摘要】
用于逆转录病毒载体的生产细胞和包装细胞及其制备方法
[0001]本专利技术涉及病毒载体领域,具体地,涉及逆转录病毒尤其是慢病毒载体领 域;更具体地,涉及逆转录病毒尤其是慢病毒载体的制备方法,用于逆转录病 毒尤其是慢病毒载体制备的生产/包装细胞以及所述细胞的制备方法。
技术介绍
[0002]逆转录病毒,又称反转录病毒,属于RNA病毒中的一类,是具有包膜的 双链RNA病毒,其主要特征在于能够将其基因组由RNA“逆转录”为DNA。病 毒粒的直径一般为100nm左右,并且包含与核衣壳(NC)蛋白形成复合体的二聚 基因组(两条相同的单股正链RNA)。其基因组被包封在蛋白衣壳(CA)中,该 衣壳还包含具有酶活性的蛋白,即反转录蛋白酶(RT),整合酶(IN)和蛋白酶(PR), 这些酶是病毒感染所必需的。基质蛋白(MA)在衣壳核外形成一个层,该层与包 膜相互作用,包膜是来源于宿主细胞膜并且包围病毒核心颗粒的脂质双层。锚 定在该包膜上的是病毒包膜糖蛋白(Env),其负责识别宿主细胞上的特异性受体 并且启动感染过程。包膜蛋白由两个亚基形成,其分别是将所述蛋白锚定在脂 膜中的跨膜(TM)亚基以及与细胞受体结合的表面(SU)亚基。
[0003]γ-逆转录病毒载体,是最通常被使用的逆转录病毒载体,在2017年所有申 报基因治疗临床实验所用的转染方法中占17.3%。目前,人们对于来源于复杂 的逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV-1)的慢病毒(Lentiviral vector)的兴趣与日 俱增,从2012年的2.9%基因治疗临床试验占比 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于制备用于生产携带目的核酸片段的逆转录病毒载体的生产细胞的方法,所述方法包括:利用睡美人(Sleeping Beauty,SB)转座子系统将逆转录病毒的gag和pol基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列中的一种或多种但非全部整合在宿主细胞的基因组中,然后利用PiggyBac(PB)转座子系统将所述逆转录病毒的gag和pol基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列中的剩余的一种或多种进一步整合在所述宿主细胞的基因组中,或者利用PB转座子系统将逆转录病毒的gag和pol基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列中的一种或多种但非全部整合在宿主细胞的基因组中,然后利用SB转座子系统将所述逆转录病毒的gag和pol基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列中的剩余的一种或多种进一步整合在所述宿主细胞的基因组中。2.一种用于制备用于生产携带目的核酸片段的慢病毒载体的生产细胞的方法,所述方法包括:利用SB转座子系统将慢病毒的gag、pol和rev基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列中的一种或多种但非全部整合在宿主细胞的基因组中,然后利用PB转座子系统将所述慢病毒的gag、pol和rev基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列中的剩余的一种或多种进一步整合在所述宿主细胞的基因组中,或者利用PB转座子系统将慢病毒的gag、pol和rev基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列中的一种或多种但非全部整合在宿主细胞的基因组中,然后利用SB转座子系统将所述慢病毒的gag、pol和rev基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列中的剩余的一种或多种进一步整合在所述宿主细胞的基因组中;优选地,利用SB转座子系统将慢病毒的gag、pol和rev基因的序列以及病毒包膜蛋白的编码序列整合在所述宿主细胞的基因组中,然后利用PB转座子系统将携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列进一步整合在所述宿主细胞的基因组中,或者利用PB转座子系统将慢病毒的gag、pol和rev基因的序列以及病毒包膜蛋白的编码序列整合在所述宿主细胞的基因组中,然后利用SB转座子系统将携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列进一步整合在所述宿主细胞的基因组中;优选地,所述慢病毒的gag、pol和rev基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列位于两个以上的构建体上,优选地,gag、pol基因的序列位于一个构建体上,rev基因的序列位于另一个构建体上,病毒包膜蛋白的编码序列位于第三个构建体上,并且携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列位于第四个构建体上;优选地,所述慢病毒的gag、pol和rev基因是HIV-1病毒的gag、pol和rev基因;优选地,所述病毒包膜蛋白选自猫白血病病毒(RD114)包膜蛋白、两性逆转录病毒包膜蛋白、嗜性逆转录病毒包膜蛋白、狒狒猿白血病病毒包膜蛋白、尼帕病毒包膜蛋白、莫科拉病毒包膜蛋白、淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒包膜蛋白、基孔肯雅病毒包膜蛋白、罗斯河病毒包膜蛋白、塞姆利基森林病毒包膜蛋白、信德比斯病毒包膜蛋白、委内瑞拉马脑炎病毒包膜
蛋白、西部马脑炎病毒包膜蛋白、流感病毒包膜蛋白、禽瘟病毒包膜蛋白、昌迪普拉病毒和皮里病毒包膜蛋白、猿免疫缺陷病毒包膜蛋白、猫免疫缺陷病毒包膜蛋白、马传染性贫血病毒包膜蛋白、埃博拉病毒包膜蛋白、狂犬病病毒包膜蛋白、杆状病毒包膜蛋白、丙型肝炎病毒包膜蛋白、猫内源反转录病毒包膜蛋白、麻疹病毒包膜蛋白、鼠白血病病毒的兼嗜性4070A和10A1、长臂猿白血病病毒的包膜蛋白、人免疫缺陷病毒的gp120和水疱性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G),更优选是水疱性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G);并且优选地,所述SB系统中使用的转座酶是SB100X,和/或所述PB系统中使用的转座酶是ePiggyBac。3.根据权利要求2所述的方法,其中所述gag、pol和rev基因、病毒包膜蛋白的编码序列和携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒中的一种或多种的转录是受控的,优选地,所述病毒包膜蛋白是VSV-G并且rev基因和VSV-G的编码序列的转录是受控的,备选地,gag、pol和rev基因以及VSV-G的编码序列的转录是受控的。4.根据权利要求3所述的方法,其中所述受控的转录是通过将所述基因或序列置于诱导表达系统的控制下实现的,所述诱导表达系统例如选自四环素诱导表达系统和Cumate诱导表达系统,优选地所述基因或序列被置于Tet-On诱导表达系统的单独控制下或Tet-On和Cumate诱导表达系统的双重控制下。5.根据权利要求4所述的方法,其中,在Tet-On诱导表达系统单独控制的情况下,rev的转录在TRE
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序列的控制下,和/或VSV-G的编码序列的转录在TRE
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序列-内含子的控制下,和/或gag、pol的转录在真核启动子-内含子或TRE
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序列-内含子的控制下,优选在TRE
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序列-内含子的控制下;在Tet-On和Cumate诱导表达系统双重控制的情况下,rev的转录在TRE
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CuO序列、TRE
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CuO序列-内含子、TRE
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序列、TRE
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CuO序列或TRE
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CuO序列-内含子的控制下,优选在TRE
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序列、TRE
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CuO序列或TRE
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CuO序列-内含子的控制下,更优选在TRE
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序列的控制下,和/或VSV-G的转录在TRE
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CuO序列、TRE
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CuO序列-内含子、TRE
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序列-内含子和TRE
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CuO序列-内含子的控制下,更优选在TRE
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CuO序列-内含子、TRE
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序列-内含子或TRE
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CuO序列-内含子的控制下,更进一步优选在TRE
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CuO序列-内含子的控制下,和/或gag、pol的转录在真核启动子-内含子、TRE
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序列-内含子、TRE
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CuO序列-内含子、TRE
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序列-内含子或TRE
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CuO序列-内含子的控制下,更优选在TRE
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CuO序列-内含子的控制下。6.根据权利要求5所述的方法,其中,在Tet-On诱导表达系统单独控制的情况下,rev的转录在TRE
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序列的控制下,VSV-G的编码序列的转录在TRE
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序列-内含子的控制下,并且gag、pol的转录在真核启动子-内含子或TRE
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序列-内含子的控制下;在Tet-On和Cumate诱导表达系统双重控制的情况下,rev的转录在TRE
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序列或TRE
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CuO序列的控制下,VSV-G的转录在TRE
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CuO序列-内含子的控制下,并且gag、pol的转录在真核启动子-内含子或TRE
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CuO序列-内含子的控制下。7.根据权利要求6所述的方法,其中在Tet-On和Cumate诱导表达系统双重控制的情况下,rev的转录在TRE
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序列的控制下,VSV-G的转录在TRE
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CuO序列-内含子的控制下,并且gag、pol的转录在TRE
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CuO序列-内含子的控制下,并且gag/pol基因在所述宿主细胞的基因组中的插入拷贝数为2-8个拷贝/细胞,并且插入在所述宿主细胞的基因组中的gag/pol与VSV-G的拷贝数之比为1:1至4:1,优选地,gag/pol基因在所述宿主细胞的基因组中的插入拷贝数为4-6个拷贝/细胞,并且插入在所述宿主细胞的基因组中的gag/pol与VSV-G的拷贝
数之比为2:1至3:1。8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法,其中利用SB转座子系统或PB转座子系统将Tet-On反式激活物蛋白的编码序列或Tet-On反式激活物蛋白的编码序列和Cumate操纵子的阻遏物CymR蛋白的编码序列整合在所述宿主细胞的基因组中,优选地,所述Tet-On反式激活物蛋白是rtTA
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,优选地,利用SB转座子系统将慢病毒的gag、pol和rev基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列以及Tet-On反式激活物蛋白的编码序列或Tet-On反式激活物蛋白的编码序列和Cumate操纵子的阻遏物CymR蛋白的编码序列整合在所述宿主细胞的基因组中,然后利用PB转座子系统将携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列进一步整合在所述宿主细胞的基因组中,或者利用PB转座子系统将慢病毒的gag、pol和rev基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列以及Tet-On反式激活物蛋白的编码序列或Tet-On反式激活物蛋白的编码序列和Cumate操纵子的阻遏物CymR蛋白的编码序列整合在所述宿主细胞的基因组中,然后利用SB转座子系统将携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列进一步整合在所述宿主细胞的基因组中。9.通过根据权利要求1-8中任一项所述的方法制备的生产细胞。10.根据权利要求9所述的生产细胞,其中所述生产细胞于2020年4月13日以保藏编号CGMCC No.19675保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。11.一种用于生产携带目的核酸片段的逆转录病毒载体的生产细胞,所述生产细胞在其基因组中整合有逆转录病毒的gag和pol基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列,所述gag和pol基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列的两端分别具有用于被SB转座酶识别的IR/DR序列或用于被PB转座酶识别的ITR序列,并且所述IR/DR序列和所述ITR序列在所述生产细胞中同时存在;优选地,所述gag和pol基因的序列以及病毒包膜蛋白的编码序列的两端分别具有用于被SB转座酶识别的IR/DR序列,而所述携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列的两端具有用于被PB转座酶识别的ITR序列,或者所述gag和pol基因的序列以及病毒包膜蛋白的编码序列的两端分别具有用于被PB转座酶识别的ITR序列,而所述携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列的两端具有用于被SB转座酶识别的IR/DR序列;优选地,所述逆转录病毒是慢病毒并且更优选是HIV-1病毒,所述生产细胞在其基因组中还整合有慢病毒的rev基因的序列,并且所述rev基因的序列的两端具有用于被SB转座酶识别的IR/DR序列或用于被PB转座酶识别的ITR序列,更优选地,所述gag、pol和rev基因的序列以及病毒包膜蛋白的编码序列的两端分别具有用于被SB转座酶识别的IR/DR序列,而所述携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列的两端具有用于被PB转座酶识别的ITR序列,或者所述gag、pol和rev基因的序列以及病毒包膜蛋白的编码序列的两端分别具有用于被PB转座酶识别的ITR序列,而所述携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列的两端具有用于被SB转座酶识别的IR/DR序列;优选地,所述病毒包膜蛋白是水疱性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G)。12.根据权利要求9所述的生产细胞或根据权利要求11所述的生产细胞,其中所述目的核酸片段序列两端具有用于位点特异性重组酶系统的识别序列,和/或所述外包膜蛋白的编码序列两端具有用于位点特异性重组酶系统的识别序列。
13.用于逆转录病毒载体的目的核酸片段和/或外包膜蛋白替换系统,所述系统包括:根据权利要求12所述的生产细胞,位点特异性重组酶系统,以及待替换的目的核酸片段和/或外包膜蛋白的编码序列,所述位点特异性重组酶系统例如是FLP-FRT或Cre-lox重组酶系统,优选地所述生产细胞中原有的目的核酸片段包含标记基因或与标记基因相连和/或所述生产细胞中原有的外包膜蛋白的编码序列与标记基因相连,优选地待替换的目的核酸片段与标记基因相连和/或待替换的外包膜蛋白的编码序列与标记基因相连,并且与待替换的目的核酸片段和/或外包膜蛋白的编码序列相连的标记基因与所述生产细胞中原有的标记基因不同,所述标记基因例如是用于真核细胞的抗性基因序列,所述抗性基因序列例如选自:潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、杀稻瘟素抗性基因、博莱霉素抗性基因;或所述标记基因例如是代谢通路筛选基因,所述代谢通路筛选基因例如选自编码二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase)、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase)、胸苷激酶(Thym...
【专利技术属性】
技术研发人员:薛博夫,杨银辉,刘科,马墨,
申请(专利权)人:深圳市深研生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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