一种核酸提取方法及其在ONT纳米孔测序中的应用技术

本发明专利技术公开了一种核酸提取方法及其在ONT纳米孔测序中的应用。该核酸提取方法依次包括如下步骤：采用NI buffer消化裂解样本，得到样本裂解液；NI buffer中含有Spermidine、Spermine、蔗糖、KCl和Tris base；琼脂糖包埋；采用EPS buffer裂解；所述EPS buffer中含有蛋白酶和十二烷基肌氨酸钠；融化，之后纯化，获得样本的核酸。实验证明，采用该方法提取的核酸具有如下优点：提高了核酸的长度和纯度；提高了ONT测序平台N50长度；操作简单，耗时短(仅4h)；能够用于ONT纳米孔测序。本发明专利技术具有重要的应用价值。的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸提取方法及其在ONT纳米孔测序中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种核酸提取方法及其在ONT纳米孔测序中的应用。

技术介绍

[0002]第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。第三代测序技术也叫从头测序技术，即单分子实时DNA测序。
[0003]第三代测序技术原理主要分为单分子荧光测序和纳米孔测序两大技术阵营。
[0004]单分子荧光测序，代表性的技术为美国螺旋生物(Helicos)的SMS技术和美国太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技术。脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。但是在Pacbio测序的过程中，是基于测序聚合酶的合成过程，所以长度很难达到或者超过100Kb，另外一方面，测序过程激光会不断的照射测序聚合酶，所以酶读长也收到了进一步的显示。(平均长度只能达到15-25Kb，最长的reads也只能达到100Kb)。
[0005]纳米孔测序，代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。新型纳米孔测序法(nanopore sequencing)是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。目前两个长读长测序平台，平均读长均可以达到20-30Kb左右，而ONT最长的一条序列已经达到1Mb，但是ONT平台却很难超过1Mb，限制其读长最大的原因在于在核酸提取的过程中，由于各种机械损伤和酶的作用，导致提取出来的核酸很难超过50Kb。由此可见，核酸的提取在一定程度限制了三代测序的发展，建立提取大于50Kb核酸的提取方法具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的为提供一种可以应用于ONT纳米孔测序的核酸提取方法。
[0007]本专利技术首先保护一种核酸提取方法，可包括如下步骤：
[0008](1)采用NI buffer消化裂解样本，得到样本裂解液；所述NI buffer中含有Spermidine、Spermine、蔗糖、KCl和Tris base；
[0009](2)完成步骤(1)后，琼脂糖包埋。
[0010]所述步骤(1)可包括如下步骤：
[0011](1-1)用含Triton-X 100的NI buffer处理样本，收集沉淀；
[0012](1-2)完成步骤(1-1)后，用含β-巯基乙醇的NI buffer重悬沉淀，再次收集沉淀；
[0013](1-3)完成步骤(1-2)后，用NI buffer重悬沉淀，重悬液即为样本裂解液。
[0014]所述步骤(1-1)中，含Triton-X 100的NI buffer可提前预冷。含Triton-X100的NI buffer和样本的比例可为(20-40mL)：1g(如(20-25mL)：1g、(25-30mL)：
[0015]1g、(30-40mL)：1g、20mL：1g、25mL：1g、30mL：1g、35mL：1g或40mL：1g)。
[0016]所述步骤(1-1)中，“用含Triton-X 100的NI buffer处理样本”具体可为将生理盐水和含Triton-X 100的NI buffer混合，然后处理样本。生理盐水和含Triton-X 100的NI buffer的体积比可为(1-3):1(如(1-2):1、(2-3):1、1:1、2:1或3:1)。生理盐水和含Triton-X 100的NI buffer可提前预冷。
[0017]所述步骤(1-1)中，处理可为冰上静置处理。处理时间可为10-15min(如10-12min、12-15min、10min、12min或15min)。
[0018]上述任一所述含Triton-X 100的NI buffer中Triton-X的浓度可为8-12％(如8-10％、10-12％、8％、10％或12％)(v/v)。
[0019]所述步骤(1-2)中，含β-巯基乙醇的NI buffer的加入量可为：每处理1g样本获得的沉淀加入3-5mL(如3-4mL、4-5mL、3mL、4mL或5mL)含β-巯基乙醇的NI buffer。
[0020]上述任一所述含β-巯基乙醇的NI buffer中β-巯基乙醇的浓度可为0.08-0.12％(如0.08-0.10％、0.10-0.12％、0.08％、0.10％或0.12％)(v/v)。
[0021]所述步骤(1-3)中，NI buffer重悬沉淀之前，可先用NI buffer洗涤沉淀1-3次(如1次、2次或3次)。
[0022]所述步骤(2)中，琼脂糖包埋可为将所述样本裂解液和琼脂糖溶液混合，充分凝固。
[0023]所述琼脂糖溶液的浓度可为1-3％(如1-2％、2-3％、1％、2％或3％)(m/v)。
[0024]所述样本裂解液和所述琼脂糖溶液混合后，琼脂糖的浓度可为0.5-1.5％(如0.5-1.0％、1.0-1.5％、0.5％、1.0％或1.5％)(m/v)。
[0025]所述琼脂糖可为低熔点琼脂糖。
[0026]所述样本裂解液和所述琼脂糖溶液混合的体积比具体可为1:1。
[0027]所述样本裂解液和所述琼脂糖溶液混合具体可为将所述样本裂解液和所述琼脂糖溶液分别在40-50℃(如40-45℃、45-50℃、40℃、45℃或50℃)预热5-10min(如5-7min、7-10min、5min、7min或10min)，然后等体积混合。
[0028]所述充分凝固具体可为待所述样本裂解液和所述琼脂糖溶液混合后，置于冰上放置20min以上(如20min、30min)。
[0029]上述任一所述方法还可包括步骤(3)：完成步骤(2)后，采用EPS buffer裂解；所述EPS buffer中含有蛋白酶和十二烷基肌氨酸钠。
[0030]所述步骤(3)具体可包括如下步骤：
[0031](3-1)用所述EPS buffer裂解；
[0032](3-2)加入PMSF终止裂解；
[0033](3-3)清洗。
[0034]所述步骤(3-1)中，用所述EPS buffer裂解的方法具体如下：向1体积份包埋产物(即步骤(2)琼脂糖包埋后的产物)中加入10体积份EPS buffer，45℃、80-100rpm振荡2h；之后弃缓冲液，保留胶块，加入胶块2倍体积的EPS buffer，50℃、80-100rpm振荡1h。
[0035]所述步骤(3-本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸提取方法，包括如下步骤：(1)采用NI buffer消化裂解样本，得到样本裂解液；所述NI buffer中含有Spermidine、Spermine、蔗糖、KCl和Tris base；(2)完成步骤(1)后，琼脂糖包埋。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)包括如下步骤：(1-1)用含Triton-X 100的NI buffer处理样本，收集沉淀；(1-2)完成步骤(1-1)后，用含β-巯基乙醇的NI buffer重悬沉淀，再次收集沉淀；(1-3)完成步骤(1-2)后，用NI buffer重悬沉淀，重悬液即为样本裂解液。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，琼脂糖包埋为将所述样本裂解液和琼脂糖溶液混合，充分凝固。4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤(3)：完成步骤(2)后，采用EPS buffer裂解；所述EPS buffer中含有蛋白酶和十二烷基肌氨酸钠。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤(4)：完成步骤(3)后，融化，之后纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄标，刘群，张家璇，陈翠，吴昊，田志坚，
申请(专利权)人：武汉华大医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：