氨基酸脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于化学催化与酶催化交叉领域，涉及氨基酸脱氢酶突变体及其应用，具体涉及有机合成、枯草芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase from B.subtilis,BsLDH)的突变改造、底物α-酮酸及其衍生物的不对称还原氨化，以及手性非天然氨基酸的化学-酶法连续反应制备过程。本发明专利技术公开的突变体，能够催化多种α-酮酸类化合物的立体选择性还原氨化，合成结构多样的非天然氨基酸。该突变体基因经过重组、转化，在E.coli Rosseta(DE3)中表达，并将其与葡萄糖脱氢酶(GDH)组成辅酶循环体系用于催化α-酮酸及其衍生物得到手性非天然氨基酸。同时，本发明专利技术以甲基酮类化合物为起始原料，构建了立体选择性制备手性非天然氨基酸的化学酶法反应过程。化学酶法反应过程。

【技术实现步骤摘要】
氨基酸脱氢酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于化学催化与酶催化交叉领域，涉及氨基酸脱氢酶突变体及其应用，具体涉及有机合成、枯草芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase from B.subtilis,BsLDH)的突变改造、底物α-酮酸及其衍生物的不对称还原氨化，以及手性非天然氨基酸的化学-酶法连续反应制备过程。

技术介绍

[0002]氨基酸在现代药物发现的早期扮演着重要角色，它们存在于诸如杆菌肽、万古霉素等抗生素中和以胰岛素为代表的多肽中。由于氨基酸类化合物结构的多样性、多肽和修饰性多肽类药物的接受度越来越高以及带有不同侧链的氨基酸在合成上的简便性，氨基酸类化合物在现代药物化学和新药发现中的地位与日俱增。其中，光学纯(S)-苯甘氨酸及其衍生物是一类潜在的先导化合物和药物合成砌块。常用的合成方法包括：酶合成法、α,β-脱氢氨基酸氢化或环加成法、Strecker型反应、亲电或亲核氨基化法以及亲电或亲核烷基化法等，但这些合成方法都或多或少地带有手性控制、反应条件和反应效益方面的不利因素。由于自身理化性质的特殊性，手性氨基酸(尤其是无修饰的游离氨基酸)的级联合成反应报道相对较少，而其中以化学-酶法从简单结构化合物制备手性氨基酸的研究则更少。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供能够催化多种α-酮酸及其衍生物的亮氨酸脱氢酶突变体；目的之二在于提供一种以苯乙酮等甲基酮类化合物为起始原料，将化学氧化与酶催化结合起来的化学-酶法连续一锅法制备手性非天然氨基酸的反应过程。
[0004]本专利技术提供了一系列由枯草芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase from B.subtilis,BsLDH)基因(SEQ ID NO.1)通过突变得到的突变体，并在大肠杆菌工程菌中表达。
[0005]相较于野生型BsLDH(SEQ ID No.2)，本专利技术所述的BsLDH突变体是将BsLDH的40位、65位、291位或294位氨基酸中的一种或多个突变为丙氨酸(Ala，A)、甘氨酸(Gly，G)或丝氨酸(Ser，S)中的一个或多个，涉及的突变体列举如下(表1.)。
[0006]表1.BsLDH及其突变体列表
[0007][0008][0009]a
突变体的表述方式。以SEQ ID No.30为例，“L40A”表示将L40(40位亮氨酸)突变为A(丙氨酸)，“/”表示同时在蛋白序列中引入另一个突变，“V294G”表示将V294(294位缬氨酸)突变为G(甘氨酸)。
[0010]进一步地，本专利技术所述的BsLDH突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60所示。
[0011]相较于野生型BsLDH(SEQ ID No.2)，所述的BsLDH突变体的氨基酸序列与序列SEQ ID No.4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60中的任意序列具有至少85％同源性，这些序列通过定点突变及组合突变的方法获得。
[0012]本专利技术包括编码所述BsLDH突变体的核酸，例如编码与本专利技术所述BsLDH突变体的核酸序列相同或具有至少85％的序列同一性的核酸。
[0013]本专利技术提供一种表达载体，该载体包含编码上述BsLDH突变体的核酸且能在宿主细胞中进行表达。
[0014]本专利技术提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的表达载体，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母和毕赤酵母等。优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。
[0015]本专利技术所述的BsLDH突变体对α-酮酸类化合物具有不同活性及良好的立体选择性，能够催化生成多种S型非天然α-氨基酸。因此，所述的BsLDH突变体可以制成生物催化剂(包括细胞、粗酶粉、酶溶液、固定化酶等多种形式)，催化α-酮酸的对映选择性还原氨化从
而获得S型非天然α-氨基酸。
[0016]本专利技术还提供了以BsLDH突变体作为催化剂制备S型非天然α-氨基酸的方法，所述方法以α-酮酸类化合物为底物，与本专利技术中的生物催化剂接触。
[0017]优选地，所述方法中的生物催化剂为包含上述BsLDH突变体或葡萄糖脱氢酶(GDH)的大肠杆菌冻干细胞；所述反应是在辅酶存在下，在pH 7-10、温度为25-50℃的NH4Cl-NH3·
H2O缓冲溶液中进行的。
[0018]其中，所述的辅酶再生系统包括但不限于NAD
+
与如下物质的组合：葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、甲酸和甲酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、仲醇(如异丙醇)和仲醇脱氢酶、亚磷酸和亚磷酸脱氢酶、分子氢和氢化酶以及电化学再生系统。优选的辅酶再生系统包含NAD
+
，与葡萄糖和GDH。
[0019]上述方法中的α-酮酸类化合物如式(I)所示，
[0020](I)
[0021]R可以为单取代或多取代的苯环、萘环、五元或六元芳香杂环和C
1-C6直链及支链脂肪族取代基；取代基可以为H、卤素、羟基、氨基、巯基、C
1-C5饱和或不饱和烷基、C
1-C5烷氧基、C
1-C5酯基、C
1-C5酰胺基。
[0022]优选地，取代基为H、羟基、C
1-C5烷氧基、硝基、卤素、C
1-C5烷基。
[0023]本专利技术提供一种提高亮氨酸脱氢酶对不同α-酮酸类化合物活性的方法，是通过突变库对α-酮酸类化合物进行活性筛选得到每种α-酮酸对应的改良突变体。
[0024]本专利技术提供一种化学氧化制备α-酮酸类化合物的方法。所述方法以甲基酮类化合物为底物，与氧化剂在有机溶剂中回流得到α-酮酸类化合物。
[0025]优选地，所述的氧化剂是二氧化硒(SeO2)；所述反应是在吡啶中，50-110℃回流3-10h后完成的；所述的甲基酮类化合物如式(II)所示，
[0026](II)
[0027]R可以为单取代或多取代的苯环、萘环、芳香杂环和C
1-C6直链及支链脂肪族取代基；取代基可以为H、卤素、羟基、氨基、巯基、C
1-C5饱和或不饱和烷基、C
1-C5烷氧基、C
1-C5酯基、C
1-C5酰胺基。
[0028]优选地，取代基为H、羟基、C
1-C5烷氧基、硝基、卤素、C
1-C5烷基。
[0029]本专利技术提供一种化学-酶法连续反应过程，以甲基酮类化合物为起始原料，一锅法反应制备手性氨基酸。该过程将化学氧化制备α-酮酸类化合物的反应结束后经过静置得到的上清液，直接加入到酶催化体系中，以连续反应的方式制得手性氨基酸。
[0030]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
酯基、C
1-C5酰胺基。12.一种化学-酶法连续反应过程，以甲基酮类化合物为起始原料，一锅法反应制备手性氨基酸，其特征在于，将权利要求11所述化学氧化反应结束后静置得到的上清液，直接加入到酶催化体系中，以连续反应的方式制得手性氨基酸，所述的化学反应结束后的上清液与酶催化体系的体积比为1:...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾娴，欧阳敬平，游松，韩冰洋，刘家岱，范多纳，张飞霆，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：