本发明专利技术公开了一种基于定量PCR鉴定鸭龄的方法。本发明专利技术基于不同年龄段鸭子肝脏的生长相关基因表达量的变化规律，利用定量PCR仪进行生长相关基因表达量测定，进而达到准确分析鸭子年龄的目的，本发明专利技术在发现鸭子肝脏中存在相关基因表达量与年龄紧密相关的基础上，通过设计生长相关基因定量分析的定量引物序列和建立定量分析鸭子年龄的技术体系，成功的形成在表达量测定有效范围判定鸭子年龄的方法。本发明专利技术方法的准确率大大提高，原来依据经验鉴定的准确率只有50％左右，而利用本发明专利技术生物标记能够将一年以上老鸭的鉴定准确率提高到99％以上。上。上。
【技术实现步骤摘要】
一种基于定量PCR鉴定鸭龄的方法
[0001]本专利技术属于家禽养殖
，尤其涉及一种基于定量PCR鉴定鸭龄的方法。
技术介绍
[0002]老鸭煲是用一年以上的成老鸭作为主料，以酸萝卜、金华火腿、香菇、干笋作为辅料，葱、姜、盐、酱油、料酒、白胡椒粉、鸡精、高汤、食用油作为调料熬制的一道江南名菜。因其味道鲜美，富含B族维生素和维生素E等，并能有效抵抗神经炎和多种炎症，还能抗衰老而被消费者喜爱。其中以江浙一带利用一年以上麻鸭为主料烹饪的老鸭煲最为盛名和鲜美。因此一年以上的老鸭价格也较普通的肉鸭和青年鸭价格要高些。由于老鸭需要有经验的厨师或长期从事人员进行主观鉴定，使得市场上不法商贩，利用青年肉鸭放养充当老鸭进行销售的情况，对于老鸭产业的进一步扩大影响较大。如何建立老鸭年龄量化指标评定方法是产业急需解决的关键问题。
[0003]目前依据鸭生命有机体的发育过程随年龄增长而变化的趋势，发现变化最为明显的生长因子相关基因为老鸭年龄鉴定的最佳模式，其中肝脏作为生命有机体受生长因子调控最为敏感的器官，具有在不同的代谢水平以适应鸭生长发育的需求。
[0004]综上所述，现有技术存在的问题是：传统老鸭鉴定方法难以量化确定，需要经验厨师烹饪后确定；并且难以标准化操作。而要解决这一问题关键就在于系统化研究不同养殖阶段的鸭关键生物标记，形成科学合理的老鸭年龄鉴定方法，为老鸭产业提供技术支撑。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供一种基于定量PCR鉴定鸭龄的方法，旨在解决传统老鸭鉴定方法难以量化确定的问题。
[0006]本专利技术是这样实现的，一种基于定量PCR鉴定老鸭的方法，该方法包括以下步骤：
[0007](1)分别提取被鉴定个体以及一组一年鸭龄以上老鸭的新鲜鸭肝脏组织的总RNA并反转录为cDNA；
[0008](2)以β
‑
Actin作为内参基因，并以年龄协同基因GSH或IGF为目标基因，定量分析检测出被鉴定个体的GSH相对
△
CT值或IGF相对
△
CT；
[0009]以及，定量分析检测出该组所述老鸭的GSH平均
△
CT值或IGF平均
△
CT值；
[0010](3)将所述GSH相对
△
CT值减去所述GSH平均
△
CT值，得到被鉴定个体的GSH相对差值
△△
CT，并计算被鉴定个体的GSH基因相对表达量2
‑△△
CT
值，当GSH基因相对表达量2
‑△△
CT
值小于统计设定值A时，判断该被鉴定个体为1年以上的老鸭；
[0011]或者，将所述IGF相对
△
CT减去所述IGF平均
△
CT值，得到被鉴定个体的IGF相对差值
△△
CT，并计算被鉴定个体的IGF表达量2
‑△△
CT
值，当IGF表达量2
‑△△
CT
值小于统计设定值B时，判断该被鉴定个体为1年以上的老鸭。
[0012]优选地，在步骤(2)中，所述定量分析检测中，IGF的定量分析的引物序列为：
[0013]IGF F：5
’‑
GGACATATGGAACGTGACA
’‑
3；
[0014]IGF R：5
’‑
CCAGATGAGGACAGGAGT
’‑
3。
[0015]优选地，在步骤(2)中，所述定量分析检测中，GSH的定量分析的引物序列为：
[0016]GSH F：5
’‑
TTGAGTGCTGCATCTCCGTT
‑3’
；
[0017]GSH R：5
’‑
GTCCACGTCCACTTCCATGT
‑3’
。
[0018]优选地，在步骤(3)中，所述统计设定值A为1.55。
[0019]优选地，在步骤(3)中，所述统计设定值B为1.84。
[0020]本专利技术克服现有技术的不足，提供一种基于定量PCR鉴定鸭龄的方法，本专利技术基于不同年龄段鸭子肝脏的生长相关基因表达量的变化规律，利用定量PCR仪进行生长相关基因表达量测定，进而达到准确分析鸭子年龄的目的。在本专利技术在发现鸭子肝脏中存在相关基因表达量与年龄紧密相关的基础上，通过设计生长相关基因定量分析的定量引物序列和建立定量分析鸭子年龄的技术体系，成功的形成在表达量测定有效范围判定鸭子年龄的方法。
[0021]相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：
[0022](1)本专利技术直接量化一年以上老鸭的生物标记分子，能够根据量化数据准确判断鸭子年龄，对于老鸭产业的现代化发展提供了必要的质量控制技术方法；
[0023](2)本专利技术系统化开发了一年以上老鸭利用生物标记鉴定的方法，较传统的依靠经验的鉴定方法更加可靠和延续，更加适合现代产业发展的需要；
[0024](3)相较于传统的老鸭年龄鉴定方法，本专利技术方法的准确率大大提高，原来依据经验鉴定的准确率只有50％左右，而利用本专利技术生物标记能够将一年以上老鸭的鉴定准确率提高到99％以上。
附图说明
[0025]图1是本专利技术实施例中被鉴定个体的GSH相对表达量平均数比较结果；
[0026]图2是本专利技术实施例中被鉴定个体的IGF相对表达量平均数比较结果。
具体实施方式
[0027]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0028]实施例1
[0029]选取10只一年鸭龄以上老鸭，宰杀后取出各个个体的肝脏组织，对各个肝脏组织执行以下操作：
[0030](1)在将干燥组织液氮冷冻，取30～50mg组织样，利用全式金Trizol UP试剂盒，提取总RNA。提取样品用核酸浓度滴度测试仪，分析总RNA浓度和纯度。当测定样品OD260/OD280(Ratio，R)在1.8～2.1范围和浓度达到500ng/uL时确定总RNA样品合格可用于后续分析。
[0031](2)利用诺唯赞RT
‑
PCR试剂盒反转录合格RNA样品，20uL体系添加总RNA量控制在1ug以内，得到cDNA样品A。
[0032](3)老鸭的GSH平均
△
CT和IGF平均
△
CT值
[0033]按照10uL 2
×
Mix buffer，2uL Primer
‑
F(上游引物)，2uL Primer
‑
R(下游引物)，2uL cDNA和4uL高纯水配制成20uL的qPCR反应体系，利用Bio
‑
Rad的CFX96型qPCR仪进行所有本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于定量PCR鉴定老鸭的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)分别提取被鉴定个体以及一组一年鸭龄以上老鸭的新鲜鸭肝脏组织的总RNA并反转录为cDNA；(2)以β
‑
Actin作为内参基因，并以年龄协同基因GSH或IGF为目标基因，定量分析检测出被鉴定个体的GSH相对
△
CT值或IGF相对
△
CT；以及，定量分析检测出该组所述老鸭的GSH平均
△
CT值或IGF平均
△
CT值；(3)将所述GSH相对
△
CT值减去所述GSH平均
△
CT值，得到被鉴定个体的GSH相对差值
△△
CT，并计算被鉴定个体的GSH基因相对表达量2
‑△△
CT
值，当GSH基因相对表达量2
‑△△
CT
值小于统计设定值A时，判断该被鉴定个体为1年以上的老鸭；或者，将所述IGF相对
△
CT减去所述IGF平均
△
CT值，得到被鉴定个体的IGF相对差值
△△
CT，并计算被鉴定个体的IGF表达量2
【专利技术属性】
技术研发人员：刘雅丽，任晋东，蒋永健，马敏彪，卢立志，李国勤，沈建良，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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