一种提高先导编辑效率的载体和方法技术

本发明专利技术公开了一种提高先导编辑效率的载体和方法。本发明专利技术公开的提高先导编辑效率的载体能转录pegRNA，该pegRNA为由靶向目的DNA片段的sgRNA、逆转录模板和引物结合位点连接得到的RNA分子，引物结合位点的3

【技术实现步骤摘要】
一种提高先导编辑效率的载体和方法


[0001]本专利技术涉及生物
中，一种提高先导编辑效率的载体和方法。

技术介绍

[0002]精确基因编辑在作物育种和基因组功能研究中发挥着重要作用。然而单碱基编辑器(ABE和CBE)编辑窗口比较窄，传统的同源重组修复(HDR)需要外源的DNA模板，系统复杂且效率较低，这极大地限制了相关工作的开展。自2019年10月以来出现的精准基因编辑新工具PE(Prime Editors)为基因编辑领域带来了重大突破(Anzalone,Randolph et al.)。新工具PE以CRISPR
‑
Cas9系统为基础，其先导编辑引导RNA是在单链引导RNA(sgRNA)的3
’
末端增加一段含有新遗传信息的逆转录模板(rtT)和引物结合位点(PBS)序列，将Cas9切口酶(H840A)与逆转录酶(M
‑
MLV)融合形成新的融合蛋白，在逆转录酶的作用下可以实现将逆转录模板中携带的新的遗传信息“写入”到植物基因组中。
[0003]在动物细胞中，PE系统在不引入双链断裂(DSB)和无需供体DNA模板情况下，可有效实现12种单碱基的自由转换和多碱基的精准插入与删除。2020年，国内已有多组科研团队相继发表文章阐述该DNA先导编辑系统在植物中的应用，但其编辑效率却有待进一步提高(Lin,Zong et al.2020)。因此，需要开发出一种能显著提高先导编辑效率的方法，以提高该系统的可用性和友好度，让精确编辑发挥更大的作用。
专利技术内容
[0004]本专利技术所要解决的技术问题是如何提高PE系统的精确编辑效率。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种DNA先导编辑系统，所述系统含有pegRNA，所述pegRNA为由靶向目的DNA片段的sgRNA、逆转录模板和引物结合位点(PBS)连接得到的RNA分子，所述引物结合位点的3
’
端和/或其中间与sgRNA的spacer的核苷酸不匹配。
[0006]上述系统中，所述引物结合位点的3
’
末端的三个核苷酸中的一个、两个或三个核苷酸与sgRNA的spacer的相应核苷酸不匹配；和/或，所述引物结合位点的3
’
末端起第七个核苷酸或其其他序列与sgRNA的spacer的相应核苷酸不匹配。
[0007]所述其他序列是指PBS的除3
’
末端的三个核苷酸与3
’
末端起第七个核苷酸外的其他核苷酸。
[0008]上述系统中，所述DNA先导编辑系统还可含有Cas9切口酶(H840A)与逆转录酶M
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MLV融合所形成的融合蛋白。
[0009]本专利技术还提供了一种载体，所述载体含有转录所述pegRNA的DNA分子。
[0010]所述DNA分子的序列可为序列4的第515
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639位。
[0011]所述载体可含有大于1个的含有转录所述pegRNA的DNA分子。
[0012]所述载体中，含有转录所述pegRNA的DNA分子的转录可由序列表中序列3的第1
‑
994位所示的DNA分子驱动或由序列表中序列4的第1
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437位所示的DNA分子驱动和/或由序列表中序列4的第811
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1334位所示的DNA分子驱动。
[0013]所述载体还可含有所述融合蛋白的编码基因。
[0014]所述融合蛋白的编码基因可为序列1的第2006
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8359位。
[0015]所述载体还可含有tRNA基因和RNA核酶基因，可选的，位于同一基因表达框中的tRNA基因、pegRNA基因及RNA核酶基因依次相连。
[0016]所述载体还可含有抗性标记基因。
[0017]所述系统或所述载体在基因编辑中的应用，也属于本专利技术的保护范围。
[0018]本专利技术还提供了一种基因编辑的方法，所述方法包括将所述载体导入待编辑体中实现基因的编辑。
[0019]所述待编辑体可为植物，如水稻。
[0020]所述系统或所述载体或所述基因编辑的方法在植物育种中的应用，也属于本专利技术的保护范围。
[0021]实验证明，本专利技术通过在PBS的中间位置引入突变碱基或者在PBS的3'端引入突变碱基可以有效提高植物中先导编辑系统的编辑效率，通过该方法得到的先导编辑系统具有很好的应用前景。
附图说明
[0022]图1为包含pegRNA的载体pG3H
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PE2
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35C和载体pG3H
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PE2
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U3结构示意图及进一步的载体构建过程示意图。
[0023]图2为序列分析。上图为在I1879位点引入突变时，rtT&PBS的序列、长度和靶点序列；OsACC基因为水稻乙酰辅酶A羧化酶基因；Target指pegRNA的靶点、rtT指逆转录模板、PBS指引物结合位点。第2部分为在PBS中引入不同突变核苷酸的rtT&PBS序列。
[0024]图3为基于突变PBS策略的不同载体在原生质体中精确编辑效率。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
[0026]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5
′
末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3
′
末端核苷酸。
[0027]pegRNA是在单链引导RNA(sgRNA)的3
’
末端增加一段含有新遗传信息的逆转录模板(rtT)和引物结合位点(PBS)序列，pegRNA根据需要编辑的靶位点设计。在下述实施例中，pegR1和pegR2相同。Spacer与sgRNA支架组成完整的sgRNA。
[0028]下表1为实施例中所用的引物、先导编辑引导RNA(pegRNA)相关序列：
[0029]表1引物、先导编辑引导RNA(pegRNA)相关序列
[0030][0031][0032]实施例1、先导编辑双元载体的构建
[0033]一、U3启动子驱动pegRNA表达的载体构建
[0034]1、分别使用引物mAmp
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BsF/tMet
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BsF(即表1中mAmp
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BsF与tMet
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Bs本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA先导编辑系统，含有pegRNA，所述pegRNA为由靶向目的DNA片段的sgRNA、逆转录模板和引物结合位点连接得到的RNA分子，所述引物结合位点的3
’
端和/或其中间与sgRNA的spacer的核苷酸不匹配。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述引物结合位点的3
’
末端的三个核苷酸中的一个、两个或三个核苷酸与sgRNA的spacer的相应核苷酸不匹配；和/或，所述引物结合位点的3
’
末端起第七个核苷酸或其其他序列与sgRNA的spacer的相应核苷酸不匹配。3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于：所述DNA先导编辑系统还含有Cas9切口酶(H840A)与逆转录酶M
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MLV融合所形成的融合蛋白。4.一种载体，含有转录权利要求1或2中所述pegRNA的DNA分子。5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述DNA分子为序列4的第515
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639位。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈其军，柴一萍，姜媛媛，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：