一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法技术

本发明专利技术公开了一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，包括以下步骤：S1多轮电转的ES克隆注射囊胚，获得低嵌合率小鼠；所述ES克隆加上EGFP表达；S2对低嵌合率小鼠进行毛色比例分析和鼠尾基因鉴定；S3小鼠精子冷冻；S4精子基因型鉴定；S5阳性比例高的精子进行体外受精IVF实验；S6受精卵培养到2细胞后进行荧光观察；S7筛选绿色荧光胚胎移植；S8出生小鼠DNA鉴定；本发明专利技术解决了多步ES技术打靶的克隆所得到的首建鼠嵌合率低生殖遗传不确定的问题。确定的问题。确定的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法


[0001]本申请涉及基因修饰模型鼠的生殖遗传比率分析方法及保种应用，属于生物
，特别涉及一种ES多次打靶获得的低嵌合率首建鼠生殖遗传的挽救方法。

技术介绍

[0002]现有的基因修饰技术：传统的转基因(TG)技术和近几年火热的CRISPR/Cas9 技术都是通过原核显微注射的方式将外源DNA注入核区，但TG方式获得的小鼠基因组是随机整合了外源DNA，表达水平也不一致；CRISPR/Cas9技术是通过Cas9 核酸酶通过sgRNA靶向切割DNA双链，诱导外源DNA与切口上下游的同源序列发生同源重组，该方法获得的小鼠基因组是定点修饰了外源DNA，但是sgRNA靶序列只有～20bp，Cas9核酸酶容易发生脱靶切割。ES(全能干细胞)打靶是建立在 DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术，目前是模式动物制备的黄金标准。ES打靶技术成功避开了转基因的随机整合和CRISPR/Cas9无法避免的脱靶效应。
[0003]近几年，人源化动物模型已经被证明在解码人类疾病奥秘中具有巨大的优势和广泛的应用前景。由于人类生理与动物生理的差异，好多在动物模型上得到的实验数据在人体上无法复现。例如，新冠病毒依赖于ACE2蛋白感染人类，但是它不能识别小鼠细胞的ACE2蛋白，所以小鼠不会感染新冠肺炎，因此需要将小鼠的ACE2基因人源化。要在小鼠体内全部模拟人的ACE2基因表达，最好的方式是将小鼠的ACE2基因组全部替换为人的ACE2基因组。这涉及到近50kb外源DNA 序列的定点插入，但常规的打靶技术无法一次性定点插入几百Kb的大片段，因此需要用到ES细胞多次打靶编辑的操作。
[0004]现有技术问题：
[0005]1.传统的TG技术和CRISPR/Cas9技术无法实现几百Kb～1Mb的基因定点修饰，受精卵脆弱，无法通过电转方式导入大片段DNA，只能显微注射，操作要求极高，受精卵数量也有限，且大片段DNA整合效率很低。如有些人源化方案中，使用人源基因组序列可能很大，需要多个BAC拼接才能囊括全，这种情况可以拆分外源DNA片段通过ES细胞多次打靶来实现。
[0006]2.但经过多次电转筛选的ES细胞全能性会受到影响，多次电击对ES细胞极大的损伤包括染色体数量及形态异常，染色体DNA断裂丢失等；如果电转次数大于5次，即便筛选核型正常的ES克隆用于注射囊胚腔，产生的嵌合体小鼠嵌合比例会很低，而且生殖遗传比例不确定。
[0007]3.现有的关于鉴定动物胚胎方法，都是通过取胚胎部分细胞确定有外源 DNA基因型后再移植到供体，且要保证胚胎损伤小，存活率高。常用的方法有三种：
①
经典的胚胎取细胞方法是显微切割法，但该方法破坏了胚胎透明带的完整性，可能造成取细胞后的胚胎碎裂。
②
通过将显微注射针刺入胚胎内，用负压吸取细胞，该方法由于使用负压操作，可能造成取细胞后的胚胎负压损伤。
③
采用“打洞压迫法”使用正压从动物胚胎中取出部分细胞，该方法对胚胎还是有损伤。以上三种方法对胚胎发育都有损伤，而且工作量和操作性要求极高，个人实验数据差异也难以避免；并且采取的细胞量极少，必须结合细胞培养和多轮
PCR 富集检验的方法鉴定基因型，鉴定周期长，PCR假阳性或假阴性概率也高。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是解决多步ES技术打靶的克隆所得到的首建鼠嵌合率低生殖遗传不确定的问题。
[0009]通过结合打靶载体的特殊方案设计(加上EGFP表达框)、精子冷冻技术(为了保种阳性精子)、精子基因型鉴定技术、体外受精技术及受精卵荧光观察来精确分析首建鼠的生殖遗传比例，并将带有荧光的囊胚移植代孕鼠产生阳性后代，没有对胚胎造成任何损伤的情况下，减少了筛选周期和代孕鼠以及鉴定成本浪费。
[0010]本专利技术的技术方案如下：
[0011]一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，包括以下步骤：
[0012]S1多轮电转的ES克隆注射囊胚，获得低嵌合率小鼠；所述ES克隆加上 EGFP表达；
[0013]S2对低嵌合率小鼠进行毛色比例分析和鼠尾基因鉴定；
[0014]S3小鼠精子冷冻；
[0015]S4精子基因型鉴定；
[0016]S5阳性比例高的精子进行体外受精IVF实验；
[0017]S6受精卵培养到2细胞后进行荧光观察；
[0018]S7筛选绿色荧光胚胎移植；
[0019]S8出生小鼠DNA鉴定。
[0020]进一步的，上述一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，所述步骤S1中，所述所述ES克隆加上EGFP表达具体为在外源DNA序列上增加EGFP表达框，同时两端加上重组酶位点以便后期删除。
[0021]进一步的，上述一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，所述EGFP表达框序列为SEQ ID NO：1。
[0022]进一步的，上述一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，所述EGFP表达框两端设计有loXP序列，具体为SEQ ID NO：2。
[0023]进一步的，上述一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，所述步骤S3中小鼠精子冷冻包括如下步骤：
[0024]a.挑选黑色毛发嵌合率高的12周龄F0小鼠，准备好冷冻保护试剂和器材；
[0025]b.将雄鼠颈椎脱臼处死，剪下双侧附睾尾置于滤纸上，去除多余组织、血迹等；
[0026]c.吸取500μL CPA于四孔板；
[0027]d.用系线镊挤压附睾尾呈饱满状态，剪开顶部取出精子团，放入冷冻液 CPA中，摇晃混匀、置于CO2培养箱内10min；
[0028]e.分装60μL/管规格存放冻存管中，放入液氮盒10min，留一管质检，剩余全部放入液氮罐保存。
[0029]进一步的，上述一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，所述步骤S4精子基因型鉴定具体步骤为：
[0030]1)精子DNA提取：每个line取一管精子样品提取DNA，使用SDS配方的裂解液裂解精子样品，再用酚氯仿抽提去掉杂质，用乙醇沉淀DNA后，加75％乙醇清洗两遍，最后用超纯水
溶解DNA；
[0031]2)基因型鉴定：
[0032]a.引物序列，F：5
’‑
ACGTAAACGGCCACAAGTTC
‑3’
＝SEQ ID NO.3
[0033]R：5
’‑
GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC
‑3’
＝SEQ ID NO.4，进行PCR，目的条带440bp。
[0034]进一步的，上述一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，所述S5阳性比例高的精子进行体外受精IVF实验包括如下步骤：
[0035]1)从液氮罐中取出精子样品的冻存管，放本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，其特征在于，包括以下步骤：S1多轮电转的ES克隆注射囊胚，获得低嵌合率小鼠；所述ES克隆加上EGFP表达；S2对低嵌合率小鼠进行毛色比例分析和鼠尾基因鉴定；S3小鼠精子冷冻；S4精子基因型鉴定；S5阳性比例高的精子进行体外受精IVF实验；S6受精卵培养到2细胞后进行荧光观察；S7筛选绿色荧光胚胎移植；S8出生小鼠DNA鉴定。2.根据权利要求1所述的一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述所述ES克隆加上EGFP表达具体为在外源DNA序列上增加EGFP表达框，同时两端加上重组酶位点以便后期删除。3.根据权利要求2所述的一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，所述EGFP表达框序列为SEQ ID NO：1。4.根据权利要求2所述的一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，所述EGFP表达框两端设计有loXP序列，具体为SEQ ID NO：2。5.根据权利要求1所述的一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，其特征在于，所述步骤S3中小鼠精子冷冻包括如下步骤：a.挑选黑色毛发嵌合率高的12周龄F0小鼠，准备好冷冻保护试剂和器材；b.将雄鼠颈椎脱臼处死，剪下双侧附睾尾置于滤纸上，去除多余组织、血迹等；c.吸取500
ꢀµ
L CPA于四孔板；d.用系线镊挤压附睾尾呈饱满状态，剪开顶部取出精子团，放入冷冻液CPA中，摇晃混匀、置于CO2培养箱内10 min；e.分装60
ꢀµ
L/管规格存放冻存管中，放入液氮盒10min，留一管质检，剩余全部放入液氮罐保存。6.根据权利要求1所述的一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，其特征在于，所述步骤S4精子基因型鉴定具体步骤为：1)精子DNA提取：每个line取一管精子样品提取DNA，使用SDS配方的裂解液裂解精子样品，再用酚氯仿抽提去掉杂质，用乙醇沉淀DNA后，加75%乙醇清洗两遍，最后用超纯水溶解DNA；2）基因型鉴定：...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏翠，姜伟，朱银峰，
申请(专利权)人：赛业苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：