表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法技术

本发明专利技术属于布鲁氏杆菌检测技术领域，公开了一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法包括：进行鲁氏杆菌抗体分组；制备纳米材料；制备SERS标记检测探针；制备拉曼免疫层析试纸条；进行试纸条性能检测。本发明专利技术提供的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，将拉曼增强技术与免疫层析技术相结合，制备出布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，在临床快速诊断中具有极大的推广和应用价值。同时，本发明专利技术方法操作简便、灵敏度高，15min内即可完成检测，在布鲁氏杆菌早期感染检测中具有广阔的应用和推广前景。前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法


[0001]本专利技术属于布鲁氏杆菌检测
，尤其涉及一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法。

技术介绍

[0002]目前，布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的，是目前世界上流行较广、危害较大的人畜共患病，引起流产、不孕以及各种组织的局部病灶。布鲁氏菌可通过鼻、咽、口腔感染，主要是通过粘膜上皮组织浸入。目前，布鲁氏菌属已有10余个种的布鲁氏菌存在，不同种的布鲁氏菌具有明显的宿主危害倾向性，但大多具有不同宿主间的交叉感染能力，可引起严重的公共卫生问题。随着我国近年来，畜牧业的快速发展，布鲁氏菌病成为了限制我国畜牧业发展的严重病害之一。
[0003]布鲁氏菌包括羊群布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌等种源。布鲁氏菌检测技术主要有虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、乳环试验(MRT)、补体结合试验(CFT)、ELISA和PCR等方法。常规方法分离鉴定病原所需条件苛刻，且费力、费时、危险性高、成功率低。PBT和SAT特异性不高、敏感性低；CFT操作繁琐，实验条件和技术水平要求高，实践应用极为不便。PCR检测方法较前几种快速也准确许多，但需要复杂的仪器设备，成本高，不适合基层和现场检测。表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scatterimg，SERS)是一种振动光谱技术，该技术灵敏度高、特异性强，将SERS与免疫层析技术结合是当前病原检测的重要研究方向之一。因此，针对这一现状，在布鲁氏杆菌检测工作中，亟需实现将SERS与免疫层析技术结合，并建立一种高灵敏度SERS
‑
免疫层析检测新技术，以快速、准确且定量检测布鲁氏杆菌的方法。
[0004]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：常规方法分离鉴定病原所需条件苛刻，且费力、费时、危险性高、成功率低；其中，PBT和SAT特异性不高、敏感性低；CFT操作繁琐，实验条件和技术水平要求高，实践应用极为不便；PCR检测方法需要复杂的仪器设备，成本高，不适合基层和现场检测。
[0005]解决以上问题及缺陷的难度为：传统技术缺陷难度主要是：耗时长；操作技术水平要求高，需要配备专业的实验室技术人员；需要复杂昂贵的仪器设备；不能进行现场的快速检测。
[0006]解决以上问题及缺陷的意义为：检测快速、准确，操作简单，无需专业人员，不需经过特殊培训，适合在基层现场进行快速检测，大大方便基层兽医工作开展。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法。
[0008]本专利技术是这样实现的，一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法包括以下步骤：
[0009]步骤一，进行鲁氏杆菌抗体分组；
[0010]步骤二，制备纳米材料；
[0011]步骤三，制备SERS标记检测探针；
[0012]步骤四，制备拉曼免疫层析试纸条；
[0013]步骤五，进行试纸条性能检测。
[0014]进一步，步骤一中，所述鲁氏杆菌抗体分组，包括：
[0015]将获得的一对鲁氏杆菌抗体所包含的鲁氏杆菌标记抗体和鲁氏杆菌捕获抗体两个鲁氏杆菌抗体进行独立存放备用。
[0016]进一步，步骤二中，所述制备纳米材料，包括：
[0017]选择步骤一获得的其中一个布鲁氏杆菌抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出20
‑
35nm的AuNPs胶体金溶液；然后在Au NPs胶体金溶液中加入8
‑
12mM的DTNB，搅拌反应3
‑
6h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入0.5
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1.5％w/v的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5
‑
1.5mM硝酸银溶液，持续沸腾10
‑
20min，得到Au/DTNB@Ag NPs；向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应3.5
‑
5.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料。
[0018]进一步，步骤三中，所述制备SERS标记检测探针，包括：
[0019]向步骤二制备得到的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，用1.5
‑
2.8mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入布鲁氏杆菌抗体孵育1.3
‑
2.5h；加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，加入用SERS检测探针复溶液重悬，制备得到布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子；对布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20
‑
40℃恒温环境下干燥3h后，即可得到SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针。
[0020]其中，所述EDC使用量为2.0
‑
3.5μL，所述NHS使用量为2.0
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3.5μL，所述BSA使用量为90
‑
120mL。
[0021]进一步，步骤四中，所述制备拉曼免疫层析试纸条，包括：
[0022]将步骤一剩余的另一个布鲁氏杆菌抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在30
‑
40℃恒温环境下干燥，其中布鲁氏杆菌抗体检测探针作为检测线T，羊抗鼠抗体作为质控线C；将干燥后的硝酸纤维素膜与步骤三制备的含SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用。
[0023]其中，所述布鲁氏杆菌抗体检测探针稀释后浓度为0.3
‑
0.7mg/mL，所述羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.3
‑
0.7mg/mL。
[0024]进一步，所述制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板；所述试纸条优化宽度为2
‑
4cm，优化长度为5
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10cm。
[0025]进一步，步骤五中，所述试纸条性能检测，包括：
[0026]采用国家标准品对步骤四所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察，通过临床样品对步骤四所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测，进而实现对步骤四所制备检测试纸条检测性能的全面评测。
[0027]进一步，所述试纸条的的灵敏度、特异性、重复性和稳定性检测，包括：
[0028](1)试纸条的灵敏度检测目的：检测试纸条的灵敏度
[0029]使用试纸条检测布鲁氏杆菌国家标准品，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法包括以下步骤：步骤一，进行鲁氏杆菌抗体分组；步骤二，制备纳米材料；步骤三，制备SERS标记检测探针；步骤四，制备拉曼免疫层析试纸条；步骤五，进行试纸条性能检测。2.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤一中，所述鲁氏杆菌抗体分组，包括：将获得的一对鲁氏杆菌抗体所包含的鲁氏杆菌标记抗体和鲁氏杆菌捕获抗体两个鲁氏杆菌抗体进行独立存放备用。3.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤二中，所述制备纳米材料，包括：选择步骤一获得的其中一个布鲁氏杆菌抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出20
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35nm的Au NPs胶体金溶液；然后在Au NPs胶体金溶液中加入8
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12mM的DTNB，搅拌反应3
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6h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入0.5
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1.5％w/v的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5
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1.5mM硝酸银溶液，持续沸腾10
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20min，得到Au/DTNB@Ag NPs；向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应3.5
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5.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料。4.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤三中，所述制备SERS标记检测探针，包括：向步骤二制备得到的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，用1.5
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2.8mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入布鲁氏杆菌抗体孵育1.3
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2.5h；加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，加入用SERS检测探针复溶液重悬，制备得到布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子；对布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20
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40℃恒温环境下干燥3h后，即可得到SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针；其中，所述EDC使用量为2.0
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3.5μL，所述NHS使用量为2.0
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3.5μL，所述BSA使用量为90
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120mL。5.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤四中，所述制备拉曼免疫层析试纸条，包括：将步骤一剩余的另一个布鲁氏杆菌抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在30
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40℃恒温环境下干燥，其中布鲁氏杆菌抗体检测探针作为检测线T，羊抗鼠抗体作为质控线C；将干燥后的硝酸纤维素膜与步骤三制备的含SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；其中，所述布鲁氏杆菌抗体检测探针稀释后浓度为0.3
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0.7mg/mL，所述羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.3
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0.7mg/mL。6.如权利要求5所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，所述制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板；所述试纸条优化宽度为2
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【专利技术属性】
技术研发人员：潘艳，韦英明，陈海兰，王冬英，蒋钦杨，郑自华，陈集成，
申请(专利权)人：广西农业职业技术学院，
类型：发明
国别省市：