用于预测胞外囊泡(EV)的促血管生成潜力的方法技术

本发明专利技术涉及用于预测胞外囊泡(EV)，优选血液来源的EV的制备物的促血管生成活性的体外方法，其中所述方法基于对转化生长因子β(TGFβ)和微RNA

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于预测胞外囊泡(EV)的促血管生成潜力的方法
[0001]本专利技术涉及预测胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)制备物的促血管生成活性的方法、其EV制备物及其治疗性应用。
[0002]胞外囊泡(EV)是在正常和病理状况两种情况下从几乎所有细胞类型脱落的小囊泡。它们主要包括由细胞质膜出芽产生的微囊泡和通过胞吐作用来源于内体膜区室的外排体。最近的证据表明，EV可充当多种病理生理过程的介质。循环EV水平的提高与血管损伤和高凝性(hypercoagulability)有关，特别是在患有糖尿病和急性冠脉综合征的患者中，表明其在驱动心血管疾病中发挥作用。此外，主要源自血小板和内皮细胞的循环EV水平提高被认为是细胞功能障碍的标志。已广泛报道了EV充当生物活性载体，并参与循环细胞和包括内皮细胞在内的许多细胞类型之间的信息交换。事实上，也提出了源自血小板的EV在动脉粥样硬化的发病机制中发挥作用。
[0003]EV主要通过递送蛋白质、活性脂质和胞外RNA来充当生物中介物，通常被称为EV载物(cargo)(Pathan M.,et al.Vesiclepedia 2019:acompendium of RNA,proteins,lipids and metabolites in extracellular vesicles.(2019)Nucleic Acids Res.47:D516
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D519)然而，研究最多的EV介导的生物过程依赖于miR转移。miR是在转录之后调节基因表达的一类非编码小RNA。miR在血清/血浆中稳定表达，并且它们独特的表达模式已被提议用作许多临床环境中的疾病指纹。此外，已经表明活化的血小板可以使用EV将功能性miR转移到血管细胞中。这进而调节ICAM
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1表达和血管炎性响应。事实上，循环EV载物的变化已显示与糖尿病中的内皮细胞和平滑肌细胞的功能障碍有关。
[0004]越来越多的证据表明，EV可充当潜在的治疗、诊断和预后工具。
[0005]心血管事件风险提高是患有糖尿病和肥胖症的患者的一个共同特征。在这些临床环境中，受损的血管形成仍然被认为是导致异常血管重塑的一种相关机制。因此，促进受损组织的新生血管形成仍然是改善患者结局所必需的。已经提出了不同的治疗方法来改善具有心血管风险因素的患者的血管重塑。然而，它们未能提供真正的益处，表明仍然需要新的治疗选项。
[0006]WO2018069408公开了以强促血管生成活性为特征的血液来源的EV的组合物。此外，WO2018069408教导了一种能够测量EV的促血管生成潜力的测试，其包括测定EV诱导细胞增殖和/或在体外管状结构形成的能力。
[0007]本专利技术基于以下发现：EV载物的组合物代表了关于这些囊泡是否表现出促血管生成活性的一个可靠预测指标。出乎意料的是，本专利技术人进行的实验研究(在下面的实验部分详细说明)揭示，基于与miR
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130a的测量值组合使用的转化生长因子β(TGFβ)的浓度，具有促血管生成活性的EV可与无活性囊泡区分开。事实上，如从ROC分析推导出的，基于上述测量值的组合的测试在灵敏性和特异性两个方面均表现出对EV促血管生成活性的强大预测能力，从而能够准确选择在受促血管生成治疗积极影响的疾病或损伤的治疗性治疗中有效的EV。
[0008]因此，本专利技术的第一方面是预测胞外囊泡(EV)组合物是否具有促血管生成活性的方法，其包括以下步骤：
[0009](a)量化EV组合物中的miR
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130a微RNA含量，以及
[0010](b)量化所述EV组合物中的转化生长因子β(TGFβ)含量；
[0011](c)确定miR
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130a含量是否高于第一预定值以及TGFβ含量是否高于第二预定值，
[0012]其中：
[0013]当所述miR
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130a含量高于所述第一预定值并且所述TGFβ含量高于所述第二预定值时，则预测所述EV组合物为具有促血管生成活性。
[0014]如本文所用，术语“促血管生成活性”是指刺激或增强血管生成和/或内皮细胞增殖。
[0015]如下文进一步详细解释的，本专利技术人对从健康供体和具有心血管风险因素的患者的血液中分离的促血管生成有效和无效EV中的微RNA(miRNA)进行了基于微阵列的表达谱分析，并出乎意料地发现了这些囊泡的促血管生成活性与miR
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130a含量之间的显著相关性。进一步的研究表明，与非活性EV相比，具有促血管生成活性的EV含有更高量的TGFβ蛋白。
[0016]不希望受任何理论束缚，本专利技术人认为，miR
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130a在促进血管生成过程中所发挥的作用可以通过该分子与参与血管生成过程的数种基因(例如KDR、HOXA5、ROCK1和EPHB6)的相互作用来解释，如本专利技术人所进行的IPA Ingenuity生物信息学分析所揭示的。此外，作为该分析的结果，在于miR
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130a控制下的基因中也发现了TGFβ和TGFBR1，这进一步证实了miR
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130a与TGFβ在驱动具有生物活性的EV的促血管生成活性中的合作。
[0017]根据本专利技术，miR
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130a核苷酸序列包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：5
’‑
CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU
‑3’
(SEQ ID NO.1)。
[0018]在根据本专利技术的方法中，对EV组合物中miR
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130a的定量优选通过基于核酸的扩增技术进行，更优选通过实时PCR进行。
[0019]在一个优选的实施方案中，通过实时PCR在EV组合物中评估的miR
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130含量作为循环阈(threshold cycle，Ct)值测量。
[0020]通常来说，通过实时PCR进行的核酸定量依赖于将扩增信号(例如荧光)针对对数标尺上的循环数作图。如本文所用，术语“Ct值”是指在核酸扩增反应的指数期期间扩增信号达到高于背景水平的强度所需的PCR循环数。因此，Ct值与样品中最初存在的靶核酸的量成反比，即靶核酸的丰度越大，Ct值就越小。用于确定实时PCR反应中背景水平的方法是良好建立的并且是本领域技术人员已知的。
[0021]更具体地，本专利技术人观察到，在来自健康对象和患者的血清EV(serum EV，sEV)二者中作为Ct值测量的miR130a含量为Ct>30预示着促血管生成无效囊泡(如在体外效力测试中测量的<50％)。
[0022]因此，本专利技术方法中的EV组合物被确定为具有高于预定值的miR130a含量。优选地，本专利技术方法中的EV组合物被确定为作为Ct值测量的miR130a含量为Ct小于或等于35、更优选Ct小于或等于33、更优选Ct小于或等于30，甚至更优选Ct包括在10至29范围内，例如10、11、12、13、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.预测胞外囊泡(EV)组合物是否具有促血管生成活性的方法，其包括以下步骤：(a)量化所述EV组合物中的miR
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130a微RNA含量，以及(b)量化所述EV组合物中的转化生长因子β(TGFβ)含量；(c)确定miR
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130a含量是否高于第一预定值以及TGFβ含量是否高于第二预定值，其中：当所述miR
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130a含量高于所述第一预定值并且所述TGFβ含量高于所述第二预定值时，则预测所述EV组合物为具有促血管生成活性。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过实时聚合酶链反应(实时PCR)将所述miR
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130a含量量化为Ct值，并且其中所述miR
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130a含量与所述Ct值之间存在负相关。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一预定值是＜30的Ct值。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述TGFβ含量通过免疫测定，优选地通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第二预定值是23pg/10
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EV的TGFβ量。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括通过效力测试来量化所述EV组合物的促血管生成活性的步骤(d)，其包括以下步骤：
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通过BrdU细胞增殖测定测试所述EV组合物以获得组合物值；
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通过BrdU细胞增殖测定测试阴性对照以获得阴性对照值；
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通过BrdU细胞增殖测定测试阳性对照以获得阳性对照值；
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通过应用以下公式计算所述BrdU细胞增殖测定中所述EV组合物的％促血管生成活性：7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括通过效力测试来量化所述EV组合物的促血管生成活性的步骤(d)，其包括以下步骤：
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通过管生成测定测试所述EV组合物以获得组合物值；
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通过管生成测定测试阴性对照以获得阴性对照值；
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通过管生成测定测试阳性对照以获得阳性对照值；
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通过应用以下公式计算所述管生成测定中所述EV组合物的％促血管生成活性：8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括通过包括根据权利要求6所述的BrdU细胞增殖测定和根据权利要求7所述的管生成体外测定二者的效力测试来量化所述EV组合物的促血管生成活性的步骤(d)。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述EV组合物被确定为具有至少50％的促血管生成活性。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述EV来自人细胞。11.制备促血管生成胞外囊...

【专利技术属性】
技术研发人员：马里亚，
申请(专利权)人：联合细胞EV股份公司，
类型：发明
国别省市：