本发明专利技术提供了一种新的鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的PCR引物(16s 200)，所述引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1。该PCR引物用于鱼类线粒体DNA序列的eDNA代谢编码。采用该PCR引物对水体中的eDNA进行PCR扩增，基于高通量测序方法，能够有效的解决水体中存在多种近缘物种条件下难以得到有效的物种特异性引物的问题，基于环境DNA监测技术，为鱼类分类学研究及其多样性保护提供有效的技术支撑。利用该PCR引物鉴定淡水鱼类物种的方法具有耗时短、操作简便、特异性强等优点。特异性强等优点。特异性强等优点。
【技术实现步骤摘要】
鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的PCR引物、试剂或试剂盒和鉴定方法
[0001]本专利技术涉及鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的PCR引物、试剂或试剂盒和鉴定方法，属于分子生态学领域。
技术介绍
[0002]由于环境变化和人类活动，全球生物多样性正在迅速减少。淡水生态系统是地球上最脆弱的生态系统之一，淡水鱼类是淡水生态系统的重要组成部分，由于气候变化、生境退化、生物入侵和过度捕捞等因素影响，淡水鱼类多样性正在迅速减少。准确评估鱼类种群和水生群落对环境变化的反应并量化鱼类群落结构和功能变化对水生生态系统的影响能力对于保护淡水生态系统和鱼类多样性至关重要。传统的鱼类监测技术，主要利用网具、钓具、电渔具、通过潜水等方式在现场采集实体标本，这种破坏性采样的缺点显而易见：对于珍稀物种、低密度的物种特别是外来入侵种的早期以及分布于复杂危险生境的鱼类，采样较为困难、甚至不具可操作性，且这些方法往往耗时费力，可能会伤害到目标物种或者破坏调查点的生态系统。
[0003]鱼类监测的另一类常用技术是声学探测法，该方法利用回声探测仪对各个水体的鱼类资源状况进行评估。研究通过回声成像，并充分结合分层拖网的鱼类取样，进行积分分配，从而得到目标强度与鱼体长度的换算关系式，最后估算水域鱼类资源量及分布，其结果相对捕捞法能更好地了解鱼类的数量和分布。然而该技术既不能对不同鱼类进行分类，同时准确的定量，还需建立在有正确的捕捞模型的基础上，目前的渔探仪均以国外海洋鱼类为标准建模，其是否适合我国的淡水鱼类存在着较大的疑问，该技术还受到水域理化指标和天气状况的限制。近年来，环境DNA(EnvironmentalDNA，eDNA)监测技术因其分子生物学手段的鉴定准确、对目标生物不造成干扰和样品采集的便利等优势，引起了广大水生生物研究人员的关注。
[0004]环境DNA是指从有机体脱落释放进入到自然环境中(如空气、水、土壤等)的DNA，包括细胞中的DNA和细胞破碎后游离出细胞外的DNA分子。在近些年来，环境DNA监测技术因其高效性、对目标生物不造成干扰和样品采集的便利等优势，引起了广大水生生物研究人员的关注。环境DNA监测技术的优势主要包括：(1)调查灵敏度高；(2)采样便利； (3)环境友好、对调查对象无损伤；(4)省时省力，调查成本低；(5)采样时间受天气等自然因素的影响更小。环境DNA监测技术在大型水生生物上的运用源自2008年Ficetola对美国牛蛙的探测研究，自此，环境DNA监测技术对水生生物的定性探测研究便开展起来，并在外来鱼类入侵监测、稀有鱼类物种的检测和鱼类群落资源调查等方面取得了良好的效果验证。比如，利用水样eDNA分析法监测密歇根湖及其周边河流中链和鳙的扩散趋势，利用水样eDNA分析法分析追踪入侵物种蓝鳃太阳鱼在日本本土及周边岛屿的扩散趋势等等，均取得了优于传统观察法的监测效果。Miya等通过对多个海洋鱼类物种的线粒体序列进行分析，设计出适用于海洋鱼类的通用引物，并与高通量测序技术相结合，验证了其在环境DNA 监测方法上的可
行性。然而，在随后的研究中发现，国外研究人员设计的淡水鱼类通用引物在国内环境使用时效果并不理想，其原因在于我国淡水常见鱼类以鲤科鱼类为主，鱼类物种间亲缘关系相对较近，而使用国外设计的鱼类通用引物进行扩增对比时，部分鱼类的扩增片段序列相同，无法达到鉴定的准确性。因此，目前国内在利用淡水鱼类通用引物进行实验时无法同时兼顾精度和广度。
技术实现思路
[0005]为了克服上述问题，基于中国淡水鱼类的DNA序列，本专利技术提供了一种新的鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的PCR引物(16s 200)，用于鱼类线粒体DNA序列的eDNA代谢编码。采用该PCR引物对水体中的eDNA进行PCR扩增，基于高通量测序方法，能够有效的解决水体中存在多种近缘物种条件下难以得到有效的物种特异性引物的问题，基于环境DNA监测技术，为鱼类分类学研究及其多样性保护提供有效的技术支撑。利用该PCR引物鉴定淡水鱼类物种的方法具有耗时短、操作简便、特异性强等优点。
[0006]一种鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的PCR引物：所述引物的核苷酸序列为序列表中的 SEQ ID NO.1。
[0007]进一步地，所述PCR引物用于鱼类线粒体DNA序列的eDNA代谢编码。
[0008]一种鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的试剂或试剂盒，含有上述所述的PCR引物。
[0009]使用上述所述的PCR引物或上述所述的试剂或试剂盒鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的方法，所述方法为使用上述所述的PCR引物对待测水体样品进行PCR扩增，扩增产物进行测序，对测序所得的序列进行校正或编辑后提交数据库进行比对，依据DNA序列相似率即可鉴定水体样品的鱼类物种。
[0010]进一步地，扩增体系以25μL计，包括以下组分：2.5μL 10
×
ExTaq Buffer(Mg
2+
Plus) (20mM)，2μL dNTP Mixture(各2.5mM)，上下游引物各1μL(10μmol/L)，0.2μL TaKaRaTaqHS，2μL DNA模板，16.3μL ddH2O。
[0011]进一步地，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60.3℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；71℃后延伸10min。
[0012]进一步地，所述扩增程序中，上述所述的PCR引物的最适退火温度为60.3℃。
[0013]鱼类线粒体DNA与核DNA相比具有分子小、结构简单、易于提取且是母系遗传等特点，因此选择线粒体DNA片段作为分析鱼类种群结构、物种分类鉴定的分子标记。在NCBI上下载了62种鱼类线粒体DNA序列(序列号及对应拉丁文名见表1)。将序列进行比对后基于线粒体16s区域进行通用引物设计。此外，将设计好的引物与NCBI上人类线粒体DNA进行比对，剔除掉可以扩增出人类线粒体DNA的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。所得引物和探针序列如下(表2)：
[0014]表1设计环境DNA通用引物所用鱼类线粒体基因登录号
[0015][0016][0017]表2鱼类通用引物序列表
[0018][0019]鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的具体方法如下：
[0020](1)样品DNA采集
[0021]根据水域的大小，设置需要调查的样点区域，在采集样点处采集柱状水层混合，冷藏带回实验室。24h内对水样进行抽滤处理，抽滤好的滤膜装入灭菌离心管后，立即放入
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20℃冰箱中保存备用，滤膜孔径为1.2μm。所获得的样品使用QIAGEN公司生产的试剂盒QIAampDNA MicroKit(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)或者其他同类试剂盒(如1.试剂盒DNeasyBlood and Tissue Kit(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)；2.试剂盒Power Water Sterivex DNAIsolation Kit(MoBio，CA)等)提本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1。2.根据权利要求1所述的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物用于鱼类线粒体DNA序列的eDNA代谢编码。3.鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的试剂或试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的PCR引物。4.使用权利要求1所述的PCR引物或权利要求3所述的试剂或试剂盒鉴定或辅助鉴定淡水鱼类物种的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1所述的PCR引物对待测水体样品进行PCR扩增，扩增产物进行测序，对测序所得的序列进行校正或编辑后提交数据库进行比对，依据DNA序列相似率即可鉴定水体样品的鱼类物种。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡文静，苏超群，张真，刘其根，胡忠军，
申请(专利权)人：信阳农林学院，
类型：发明
国别省市：
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