本发明专利技术提供了一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体、基因编辑系统及基因编辑方法，涉及基因编辑技术领域。本发明专利技术对现有的水稻基因编辑用载体pHUC411进行改造，用en35s启动子、PsCas9的编码基因和PsU6.3分别替换掉pHUC411上原有的ZmUBI、OsCas9和OsU3。利用所述CRISPR/Cas9基因编辑载体构建CRISPR/Cas9基因编辑系统，并对豌豆进行基因编辑，在豌豆中的基因编辑效率可高达8.32％，并且产生了高达7种的突变类型，从而提高了豌豆基因编辑效率，为豌豆的基因功能研究以及遗传育种奠定良好的基础。的基础。的基础。
【技术实现步骤摘要】
一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体、基因编辑系统及基因编辑方法
[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体涉及一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体、基因编辑系统及基因编辑方法。
技术介绍
[0002]豌豆(Pisum sativum L.)是世界四大食用豆类作物之一，种植国家已经超过90个。温带和亚热带地区的膳食蛋白质来源主要是豌豆。尽管豌豆的种植面积很大，但总产量仍然很低，在过去几十年里一直停滞不前。一些生物和非生物胁迫严重影响着豌豆的产量；此外，豌豆是自花授粉，遗传基础狭窄，而且豌豆一些性状的遗传变异有限，因此需要利用生物技术来实现对豌豆性状的改良。
[0003]基因组编辑技术是指通过核酸内切酶在基因组中特定位置产生DNA双链断裂(DSB)，诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)来修复断裂的双链DNA，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。因此基因编辑技术，可以通过基因组的定点修饰调控基因的表达，作为研究基因功能的重要工具。
[0004]CRISPR/Cas系统是存在于细菌和古细菌的获得性免疫系统，负责抵御噬菌体感染、质粒接合和转化等所造成的外源遗传物质入侵。CRISPR/Cas系统可特异性地识别外源DNA，切割并沉默外源基因的表达。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行作物遗传改良具有很多优点，现已成功运用于多种作物如水稻、小麦、玉米、棉花等的遗传改良。但是到目前为止，在豌豆中运用CRISPR/Cas9基因编辑技术还未有任何报道。
专利技术内容
[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体、基因编辑系统及基因编辑方法，所述基因编辑载体和基因编辑系统适用于豌豆，且编辑效率高，为豌豆的基因功能研究以及遗传育种奠定良好的基础。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体，所述载体以pHUC411为骨架载体，还包括豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白的编码基因、增强型的TM2
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pd35s
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dMac启动子和豌豆内源U6启动子。
[0008]优选的，所述豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]优选的，所述增强型的TM2
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pd35s
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dMac启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]优选的，所述豌豆内源U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]本专利技术还提供了上述CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，包括以下步骤：用增强型的TM2
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pd35s
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dMac启动子、豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白的编码基因和豌豆内源U6启动子分别替换掉pHUC411上原有的ZmUBI启动子、OsCas9和OsU3启动子。
[0012]本专利技术还提供了一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑系统，在上述CRISPR/Cas9基因编辑载体上连接豌豆基因靶标的引物对。
[0013]优选的，所述豌豆基因靶标包括豌豆八氢番茄红素脱氢酶基因的外显子区域，识别的PAM序列为NGG。
[0014]优选的，所述豌豆基因靶标包括PsPDS1、PsPDS2或PsPDS3。
[0015]本专利技术还提供了上述CRISPR/Cas9基因编辑载体或上述CRISPR/Cas9基因编辑系统在提高豌豆基因编辑效率中的应用。
[0016]本专利技术还提供了一种豌豆基因编辑方法，包括以下步骤：将基于豌豆基因靶标设计的引物对退火后连接上述CRISPR/Cas9基因编辑载体，转化到发根农杆菌感受态细胞中，进行遗传转化，得豌豆基因编辑植株。
[0017]有益效果：本专利技术提供了一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体，对现有的水稻基因编辑用载体pHUC411进行改造，用增强型的TM2
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pd35s
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dMac(简称en35s)启动子、豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白(简称PsCas9)的编码基因和豌豆内源U6启动子(简称PsU6.3)分别替换掉pHUC411上原有的玉米Ubiquitin启动子(ZmUBI)、水稻偏好密码子优化过的Cas9蛋白(OsCas9)和水稻内源U3启动子(OsU3)，从而使得PsU6.3驱动sgRNA的表达，en35s驱动PsCas9的表达。
[0018]利用所述CRISPR/Cas9基因编辑载体构建CRISPR/Cas9基因编辑系统，并对豌豆进行基因编辑，在豌豆中的基因编辑效率可高达8.32％，是传统的水稻、拟南芥上基因编辑工具的8倍，并且产生了高达7种的突变类型，从而提高了豌豆基因编辑效率，为豌豆的基因功能研究以及遗传育种奠定良好的基础。
附图说明
[0019]图1为pHUC411的质粒结构；
[0020]图2为本专利技术所述豌豆CRISPR/Cas9基因编辑系统的靶标设计图。
具体实施方式
[0021]本专利技术提供了一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体，所述载体以pHUC411为骨架载体，还包括豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白的编码基因、增强型的TM2
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pd35s
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dMac启动子和豌豆内源U6启动子。
[0022]本专利技术所述骨架载体的质粒结构优选如图1所示(pHUC411
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gttt；来自安徽省农业科学院水稻研究所生物技术研究室魏鹏程研究员课题组)，其内包含有玉米Ubiquitin启动子(ZmUBI)、水稻偏好密码子优化过的Cas9蛋白(OsCas9)和水稻内源U3启动子(OsU3)，分别用增强型的TM2
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pd35s
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dMac(简称en35s)启动子、豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白(简称PsCas9)的编码基因和豌豆内源U6启动子(简称PsU6.3)对上述结构进行替换，得本专利技术所述豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体。
[0023]本专利技术所述PsCas9的5＇端优选包括酶切位点Pst I和Kozak序列，3＇端包括酶切位点Sac I，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0024]本专利技术所述en35s启动子的5＇端和3＇端优选分别包括酶切位点Hind III和Pst I，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。
[0025]本专利技术所述PsU6.3启动子的5＇端和3＇端分别包含酶切位点Hind III和Pst I，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示。
[0026]本专利技术还提供了上述CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，包括以下步骤：用增强型的TM2
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pd35s
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dMac启动子、豌豆偏好密码子优化的Ca本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种豌豆CRISPR/Cas9基因编辑载体，所述载体以pHUC411为骨架载体，还包括豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白的编码基因、增强型的TM2
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pd35s
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dMac启动子和豌豆内源U6启动子。2.根据权利要求1所述CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，所述豌豆偏好密码子优化的Cas9蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，所述增强型的TM2
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pd35s
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dMac启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，所述豌豆内源U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.权利要求1～4任一项所述CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：用增强型的TM2
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pd35s
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dM...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨涛，李冠，宗绪晓，刘荣，魏鹏程，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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