一种鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条及其检测方法技术

本发明专利技术提出一种鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条及其检测方法，试纸条自一端至另一端依次设有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线；检测线靠近金标垫一端设置，质控线靠近吸水垫一端设置；金标垫上设有与胶体金偶连的单克隆抗体，单克隆抗体由保藏号为D8的杂交瘤细胞株分泌产生；检测线由保藏号为E8的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体构成；质控线由羊抗鼠抗体构成。本发明专利技术的鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条，由于采用了可相互配对的单克隆抗体分别喷涂于金标垫和检测线，对鲍氏志贺氏菌的检测特异性和灵敏度均较高，具有操作简便，低成本快速检测的特点，可实现对大量鲍氏志贺氏菌样品的现场监控。品的现场监控。品的现场监控。

【技术实现步骤摘要】
一种鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条及其检测方法


[0001]本专利技术涉及细菌检测
，尤其涉及一种鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条。

技术介绍

[0002]鲍氏志贺氏菌是一种革兰氏阴性短小杆菌，是人类和灵长类动物的肠道致病菌。鲍氏志贺氏菌主要通过粪
‑
口途径传播，感染后引发腹痛、腹泻，严重时可能导致神经衰弱等症状。该食源性致病菌主要存在于沙拉(虾、土豆、鸡)、生蔬菜、奶类、水果和面包制品中。在食物的生产、加工和运输中，由于交叉感染，易导致鲍氏志贺氏菌感染事件的大规模爆发。
[0003]目前，鲍氏志贺氏菌检测主要依赖于国标规定的传统培养法及生化鉴定，其被视为鲍氏志贺氏菌检测的金标准。但是，该方法检测耗时，操作繁琐，不适合大批量样品检测。实验室常用的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)进行鲍氏志贺菌的检测，其灵敏度高，但需依靠专业的设备和操作人员，耗时长。免疫学检测由于检测周期短、操作方便、灵敏度较高，成为近年来发展迅速的检测手段。但是，我国目前尚未有可用于鲍氏志贺氏菌检测的快速检测产品。该专利以鲍氏志贺氏菌为检测靶标，所要求保护的技术涉及鲍氏志贺氏菌的快速检测产品。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提出一种对鲍氏志贺氏菌实现有效检测，并且灵敏度高，用料节约，经济性优的鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条及其检测方法。
[0005]为达到上述目的，本专利技术提出一种鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条，所述试纸条自一端至另一端依次设有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
[0006]所述硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线；所述检测线靠近所述金标垫一端设置，所述质控线靠近所述吸水垫一端设置；
[0007]所述金标垫上设有与胶体金偶连的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为D8的杂交瘤细胞株分泌产生；所述检测线由保藏号为E8的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体构成；所述质控线由羊抗鼠抗体构成。
[0008]进一步的，还包括一块背衬，所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均承载于所述背衬上。
[0009]根据权利要求1所述的鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于，在与胶体金偶连的单克隆抗体中，所述胶体金的粒径为30～40nm，所述胶体金与单抗的质量体积比为3μg/mL。
[0010]进一步的，所述胶体金的最适pH确定如下：
[0011]取多组胶体金溶液，每组溶液中加入不同量的0.2mol/L碳酸钾调整溶液调节所述胶体金溶液的pH，并且加入D8单克隆抗体进行反应，随后加入10μL10％NaCl溶液持续反应，
进行离心操作，离心后观察到胶体金颜色最红，无聚沉、无褪色或变色现象的该组胶体金溶液为胶体金的最适pH。
[0012]进一步的，D8单克隆抗体与胶体金偶联的最佳结合量为：
[0013]取多组最适pH的胶体金溶液，每一组加入不同量的D8单克隆抗体，反应后，每一组均加入10μL 10％NaCl溶液，取颜色最红且抗体用量最少的为最小结合量xμg/mL，为保证胶体金完全与抗体结合，以x+x
×
2为最佳结合量。
[0014]进一步的，与胶体金偶连的单克隆抗体制备如下：胶体金pH调节至最佳pH值，按D8单克隆抗体与胶体金偶联的最佳结合量吸取抗体以40μL/min滴加到胶体金溶液中，同时在磁力搅拌器上搅拌，待抗体加完后于4℃环境中持续搅拌1h，加入所述胶体金溶液1/10体积的含10％BSA的PB溶液，搅拌1h，移入离心管1000rpm离心10min，小心吸取上清至新离心管，将上清12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用原胶体金溶液1/10体积的重悬液重悬，混合均匀后4℃保存备用。
[0015]本专利技术还提出一种鲍氏志贺氏菌的检测方法，样品滴在样品垫上，顺着金标垫、硝化纤维素膜和吸水纸的方向层析；
[0016]若样品中含有目标细菌，目标细菌与金标垫上的胶体金偶联的单克隆抗体结合，形成胶体金偶联抗体—细菌复合物，所述复合物流经检测线时，被检测线的单克隆抗体所捕获，形成胶体金偶联单克隆抗体—细菌—捕获抗体的三元复合物，使检测线出现可视化的颜色；随着继续层析，复合物被质控线上的羊抗鼠抗体捕获，质控线呈现可视化的颜色；
[0017]若样品不含目标细菌，当样品流经金标垫时，胶体金偶联的单克隆抗体随样品层析，最终到达质控线，被质控线的羊抗鼠抗体捕获，质控线呈现可视化的颜色。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的优势之处在于：本专利技术采用了能相互配对的单克隆抗体分别设置于检测线和金标垫，结果表明能够检测鲍氏志贺氏菌，且检测灵敏度较高。
[0019]本专利技术通过对胶体金偶连的单克隆抗体的最适pH，D8单克隆抗体与胶体金偶联的最佳结合量进行探索，从而使用最少的原料实现对目标细菌的检测，实现检测最经济的目的。
附图说明
[0020]图1为本专利技术实施例中鲍氏志贺氏菌免疫胶体金试纸条的胶体金的紫外吸收光谱图；
[0021]图2为本专利技术实施例中鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条的结构示意图；
[0022]图3是专利技术实施例中鲍氏志贺氏菌免疫胶体金试纸条检测鲍氏志贺氏菌的灵敏度结果。
[0023]图4是专利技术实施例中鲍氏志贺氏菌免疫胶体金试纸条检测其他30株食源性致病菌(非鲍氏志贺氏菌)的交叉反应结果。
[0024]图5A是专利技术实例中模拟鲍氏志贺氏菌感染白菜样品后免疫胶体金试纸条检测结果。
[0025]图5B是专利技术实例中模拟鲍氏志贺氏菌感染面包样品后免疫胶体金试纸条检测结果。
[0026]图5C是专利技术实例中模拟鲍氏志贺氏菌感染牛奶样品后免疫胶体金试纸条检测结
果。
具体实施方式
[0027]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案作进一步地说明。
[0028]首先介绍本专利技术实施例中所使用的菌株、试剂与仪器：
[0029]使用的鲍氏志贺氏菌菌株编号为CMCC51346。
[0030]使用的其它食源性致病菌(非鲍氏志贺氏菌)菌株如表1所示。
[0031]表1本专利技术所用其它食源性致病菌
[0032][0033][0034]主要试剂：
[0035]BSA、PEG、TWEEN
‑
20来自Sigma；氯金酸来自上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)135S Millipore；羊抗鼠、HRP
‑
羊抗鼠生工生物工程股份有限公司。
[0036]主要仪器：
[0037]酶标仪SpectraMax M2购自Molecular Devices；Nanodrop 2000C购自Thermo Scientific；点样仪AD6010购自BIO
‑
DOT；扫描仪Phantom V9购自MICROTEK；恒温培养摇床SPH
‑
100B购自上海世平；单人本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于，所述试纸条自一端至另一端依次设有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线；所述检测线靠近所述金标垫一端设置，所述质控线靠近所述吸水垫一端设置；所述金标垫上设有与胶体金偶连的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为D8的杂交瘤细胞株分泌产生；所述检测线由保藏号为E8的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体构成；所述质控线由羊抗鼠抗体构成。2.根据权利要求1所述的鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于，还包括一块背衬，所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均承载于所述背衬上。根据权利要求1所述的鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于，在与胶体金偶连的单克隆抗体中，所述胶体金的粒径为30～40nm，所述胶体金与单抗的质量体积比为3μg/mL。3.根据权利要求1所述的鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于，所述胶体金的最适pH确定如下：取多组胶体金溶液，每组溶液中加入不同量的0.2mol/L碳酸钾调整溶液调节所述胶体金溶液的pH，并且加入D8单克隆抗体进行反应，随后加入10μL10％NaCl溶液持续反应，进行离心操作，离心后观察到胶体金颜色最红，无聚沉、无褪色或变色现象的该组胶体金溶液为胶体金的最适pH。4.根据权利要求3所述的鲍氏志贺氏菌免疫胶体金检测试纸条，其特征在于，D8单克隆抗体与胶体金偶联的最佳结合量为：取多组最适pH的胶体金溶液，每一组加入不同量的D8单克隆抗体，反应后，每一组均加入10μL 10％NaCl溶液，取颜色最红且...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，吴有雪，吴美娇，刘程，方水琴，田亚晨，刘涛，杨昊，刘箐，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：