硫代磷修饰适配子、硫代磷修饰适配子偶联T细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种硫代磷修饰适配子、硫代磷修饰适配子偶联T细胞及其制备方法与应用，所述硫代磷修饰适配子为将适配子5

【技术实现步骤摘要】
硫代磷修饰适配子、硫代磷修饰适配子偶联T细胞及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，特别涉及一种硫代磷修饰适配子、硫代磷修饰适配子偶联T细胞及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]核酸适配子(aptamer)是一种基于SELEX技术筛选获得的单链DNA或RNA(通常是25
‑
90个核苷酸碱基)，亦被称为“核酸抗体”，可通过折叠成三级结构与靶分子结合,在功能上被用作拮抗剂，激动剂或靶向配体。适配子本质是一种可以特异性结合某些糖表位，多肽，金属离子等分子的寡核苷酸片段。以目的分子或者细胞为结合靶点，通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选得到。适配子最大的优点在于，一，合成成本低，合成速度快，可大量合成。二，分子量小，代谢速度快，渗透性强。三，免疫原性低，有较强抵抗高温，PH变化和有机溶剂破坏的能力，且能根据实际需要对其加以修饰。适配子的这些特性使其在诊断治疗等生物医学领域具有极大的应用潜能，基于这些优势，适配子的研究项目在日益增多，获得的适配子可广泛用于生物诊断，生物标志物发现，体分子成像，靶向治疗和药物递送。美国食品药品管理局(FDA)批准了第一个适配体药物pegaptanib(商品名Macugen)用于治疗老年性黄斑变性新型血管形成(AMD)，标志适配子药物正式进入临床治疗。
[0003]然而现有的核酸适配子的稳定性尚有待提高，因此有必要开发一种稳定性高的核酸适配子及其靶向T细胞。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的是提供一种硫代磷修饰适配子、硫代磷修饰适配子偶联T细胞及其制备方法与应用，该硫代磷修饰适配子亲和力高，稳定性高；该硫代磷修饰适配子偶联T细胞可以更好的识别靶细胞，能用于过继靶向治疗和杀伤肿瘤细胞。
[0005]在本专利技术的第一方面，提供了一种硫代磷修饰适配子，所述硫代磷修饰适配子为将适配子的5
’
端末端四个核苷酸间的3个磷酸二酯键进行硫代磷酸化修饰而获得。
[0006]进一步地，所述硫代磷修饰适配子包括硫代磷修饰的PDL1适配子，其中所述PDL1适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]进一步地，所述硫代磷修饰适配子还包括：在所述适配子的核苷酸序列上结合生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇和叶酸标记中的至少一种。
[0008]在本专利技术的第二方面，提供了一种硫代磷修饰适配子偶联T细胞，所述硫代磷修饰适配子偶联T细胞为：将所述的硫代磷修饰适配子经DBCO修饰后与表面携带有叠氮基的激活T细胞偶联获得。
[0009]在本专利技术的第三方面，提供了一种硫代磷修饰适配子偶联T细胞的制备方法，所述方法包括：
[0010]将所述的硫代磷修饰适配子采用DBCO进行修饰，获得DBCO
‑
硫代磷修饰的适配子；
[0011]通过糖代谢途径在CD3
+
T细胞表面表达叠氮键，获得表面携带有叠氮基的激活T细胞；
[0012]将所述DBCO
‑
硫代磷修饰的适配子与所述表面携带有叠氮基的激活T细胞进行偶联，获得硫代磷修饰适配子偶联T细胞。
[0013]进一步地，所述将所述的硫代磷修饰适配子采用DBCO进行修饰，获得DBCO
‑
硫代磷修饰的适配子，包括：
[0014]采用硫代磷酸化引物对适配子5
’
端末端四个核苷酸间的3个磷酸二酯键进行硫代磷酸化修饰，获得硫代磷修饰适配子；
[0015]将所述硫代磷修饰适配子采用DBCO进行修饰，获得DBCO
‑
硫代磷修饰的适配子。
[0016]进一步地，所述通过糖代谢途径在CD3
+
T细胞表面表达叠氮键，获得表面携带有叠氮基的激活T细胞，包括：
[0017]通过磁珠分选获得CD3
+
T细胞；
[0018]将anti
‑
CD3、anti
‑
CD28和白细胞介素
‑
2与所述CD3
+
T细胞进行共培养，获得体外激活CD3
+
T细胞；
[0019]将所述体外激活CD3
+
T细胞与叠氮修饰的甘露糖胺共培养，以使得在CD3
+
T细胞表面表达叠氮基，获得表面携带有叠氮基的激活T细胞。
[0020]进一步地，所述将所述DBCO
‑
硫代磷修饰的适配子与所述表面携带有叠氮基的激活T细胞进行偶联，获得硫代磷修饰适配子偶联T细胞，包括：
[0021]将所述DBCO
‑
硫代磷修饰的适配子与所述表面携带有叠氮基的激活T细胞进行共培养，获得硫代磷修饰适配子偶联T细胞。
[0022]在本专利技术的第四方面，提供了一种所述的硫代磷修饰适配子和/或所述的硫代磷修饰适配子偶联T细胞在制备肿瘤诊断药物或抗肿瘤药物中的应用。
[0023]在本专利技术的第五方面，提供了一种抗病毒的药物，所述药物的活性成分包括如权利要求4所述的硫代磷修饰适配子偶联T细胞。
[0024]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0025]本专利技术提供一种硫代磷修饰适配子、硫代磷修饰适配子偶联T细胞及其制备方法与应用，将适配子的5
’
端末端四个核苷酸间的3个磷酸二酯键进行硫代磷酸化修饰可以明显增强适配子的稳定性。用非天然糖如ManNAz培养细胞以后，非天然糖经过细胞内的糖代谢途径以后进入到天然糖所在的位置，使细胞表面糖蛋白糖链携带N3基。然后用DBCO标记的硫代磷修饰适配子与非天然糖培养的T细胞共孵育，便得到PS
‑
aptamer
‑
T。用于增强适配子标记T细胞在体内的稳定性进行肿瘤靶向杀伤，由于适配子稳定性增强，该PS修饰的适配子偶联的T细胞可以更好的识别靶细胞，能用于过继靶向治疗和杀伤肿瘤细胞等。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0027]图1为激活人T细胞的制备与鉴定结果；图1A为激活培养的PBMC中T细胞相关指标(激活的PBMC中T细胞简称aCD3
+
T，未激活的简称CD3
+
T)；图1B为ELISA检测T细胞体外培养自身释放的TNF
‑
α含量；
[0028]图2为ELISA检测修饰后适配子稳定性的检测结果；
[0029]图3为修饰后适配子与靶细胞的亲和力变化检测结果；图3A为流式细胞术检测aptPDL1与高表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种硫代磷修饰适配子，其特征在于，所述硫代磷修饰适配子为将适配子的5
’
端末端四个核苷酸间的3个磷酸二酯键进行硫代磷酸化修饰而获得。2.根据权利要求1所述的一种硫代磷修饰适配子，其特征在于，所述硫代磷修饰适配子包括硫代磷修饰的PDL1适配子，其中所述PDL1适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的一种硫代磷修饰适配子，其特征在于，所述硫代磷修饰适配子还包括：在所述适配子的核苷酸序列上结合生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇和叶酸标记中的至少一种。4.一种硫代磷修饰适配子偶联T细胞，其特征在于，所述硫代磷修饰适配子偶联T细胞为：将权利要求1所述的硫代磷修饰适配子经DBCO修饰后与表面携带有叠氮基的激活T细胞偶联获得。5.一种硫代磷修饰适配子偶联T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的硫代磷修饰适配子采用DBCO进行修饰，获得DBCO
‑
硫代磷修饰的适配子；通过糖代谢途径在CD3
+
T细胞表面表达叠氮键，获得表面携带有叠氮基的激活T细胞；将所述DBCO
‑
硫代磷修饰的适配子与所述表面携带有叠氮基的激活T细胞进行偶联，获得硫代磷修饰适配子偶联T细胞。6.根据权利要求5所述的一种硫代磷修饰适配子偶联T细胞的制备方法，其特征在于，所述将权利要求1所述的硫代磷修饰适配子采用DBCO进行修饰，获得DBCO
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硫代磷修饰的适配子，包括：采用硫代磷酸化引物对适配子5
’
端末端四个核苷酸间的3个磷酸二酯键进行硫代磷酸化修饰，获得硫代磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：章晓联，李超凡，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：